薄壳山核桃SRAP标记体系的优化和遗传多样性分析

为确立薄壳山核桃SRAP-PCR反应体系,并对薄壳山核桃品种遗传多样性进行分析,以薄壳山核桃嫩叶提取的DNA为模板,进行Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶4个因素3个水平[L9(34)]正交试验,并比较了不同浓度模板DNA对PCR扩增效果的影响。结果显示:薄壳山核桃的SRAP-PCR最佳反应体系为Mg2+2.5mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、引物0.4μmol/L、TaqDNA聚合酶1.5 U。DNA模板最佳浓度为10 ng利用最佳反应体系对薄壳山核桃进行引物组合多态性筛选,从90个引物组合中筛选出多态性引物组合39个。14个多态较高的引物组合对12个薄壳山核桃品种进行遗传多样性分析,通过PCR扩增,得到128个谱带,显示了较高的多态性,12个供试薄壳山核桃品种的遗传背景具有丰富的多样性。表明SRAP标记可应用于薄壳山核桃分子生物学研究。     

黄花苜蓿SSR-PCR反应体系的优化

对黄花苜蓿SSR-PCR扩增体系的反应条件进行了优化,分析了Mg2+浓度、dNTP浓度、DNA模板浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度对PCR扩增结果的影响.结果表明:在25μL的反应体系中,dNTPs的最佳浓度为0.2mmol/L,Mgcl2的最佳浓度为2.0mmol/L,DNA模版最适加入量80ng,引物的最佳浓度为0.16gmol/L,TaqDNA聚合酶的最佳用量为1U.     

苔藓植物SRAP反应体系的优化

以黄灰藓总DNA为材料,对影响SRAP-PCR反应的模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度等因素进行了优化,分析了各因素对SRAP-PCR扩增结果的影响。结果表明,在25μLSRAP-PCR反应体系中,最佳反应条件为:模板DNA40ng;Mg2+浓度2.0mmol/L;dNTP浓度0.2mmol/L;正反引物15pmol;TaqDNA聚合酶2.0U。在此条件下,引物组合Me5/em7对13种苔藓植物扩增的条带清晰、多态性好,表明此反应条件适合于苔藓植物的SRAP-PCR反应体系。     

濒危植物珙桐ISSR-PCR反应体系的建立

以珙桐叶片为材料,通过单因子试验分别研究了退火温度、TaqDNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2 浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,建立了适宜于珙桐ISSR分析的扩增体系,即25μl的反应体系中:模板DNA20 ng,Mg2 1.5 mmol/L,引物0.6μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U。     

椰子SSR反应体系的建立和优化

为摸索适宜椰子的SSR反应体系,分析了PCR反应体系中的Mg2 浓度、引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板浓度以及退火温度对扩增结果的影响,建立了适合椰子的SSR反应体系。研究结果表明:在20μL反应体系中,Mg2 、引物和dNTP的最适浓度分别为2.5 mmol/L、0.3μmol/L、0.2 mmol/L;TaqDNA聚合酶的最佳使用量为1 U,模板DNA应加入50 ng,引物最佳退火温度比Tm值较小者低2~3℃。在参数优化的基础上,应用标记分析该反应体系对24个海南不同地区高种椰子样品进行SSR分析,不同样品间DNA谱带多态性丰富,本研究建立的分析体系将为今后椰子资源的SSR分析奠定良好的研究基础。     

大叶石上莲ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立并优化大叶石上莲(Oreocharis benthamii)ISSR-PCR反应体系,采用改良的CTAB法提取大叶石上莲叶片DNA,利用正交试验设计方法,从Mg~(2+)、d NTP、引物、Taq DNA聚合酶以及模板DNA 5因素4水平,对大叶石上莲ISSR-PCR反应体系进行优化,确立了适用于大叶石上莲的扩增多态性高、稳定性强、条带清晰的ISSR最佳反应体系:2.0μL的10×PCR缓冲液,2.0 mmol/L Mg~(2+),0.25 mmol/L d NTP,0.7μmol/L引物,2.0 U TaqDNA聚合酶,30 ng DNA模板(20μL反应体系)。在此基础上,从100条引物中筛选出13条ISSR扩增引物,其中5条引物最为合适并已确定其最佳退火温度。     

新疆野核桃SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选

利用正交设计对新疆野核桃序列相关扩增多态性PCR(SRAP-PCR)反应体系中的5个因素(模板DNA、Mg2+、引物、d NTPs、Taq DNA聚合酶浓度)在5水平上进行优化,对比不同浓度模板DNA对扩增结果的影响,建立了新疆野核桃SRAP最佳反应体系。结果表明,优化的新疆野核桃SRAP-PCR最佳反应体系为:20μL的反应体系中,2.5μg/m L模板DNA、0.4μmol/L引物、2 mmol/L Mg~(2+)、0.2 mmol/L d NTPs、25 U/mL Taq酶U;最佳PCR扩增程序的退火温度为54℃。各因素扩增结果表明,Mg~(2+)浓度对扩增反应结果影响最大,d NTPs浓度影响最小。运用该体系对新疆野核桃样本进行了验证,表明该体系扩增稳定可靠。用该体系对100个SRAP引物组合进行筛选,筛选出15个扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合,为新疆野核桃种质资源研究奠定了基础。     

利用正交设计法优化观赏贝母ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计的方法,对观赏贝母ISSR-PCR反应体系的5因素(模板DNA、引物、Mg<'2+>、dNTP、TaqDNA聚合酶的浓度)在4水平上进行优化试验,PCR结果用Mnitab数据处理软件分析,建立的最佳反应体系(20 μL)为:模板DNA 10 ng、引物0.5μmoL/L、Mg<'2+> 2.5 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、Taq DNA聚合酶2.0 U.对观赏贝母IS-SR-PCR最佳反应体系进行了梯度退火试验,得到的最佳退火温度为57.9℃.     

黄秋葵SRAP反应体系的优化

通过研究黄秋葵SRAP反应体系中主要因子TaqDNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度和DNA模板浓度对扩增结果的影响,建立黄秋葵SRAP-PCR反应的优化体系。根据试验确定黄秋葵SRAP反应体系为20μL,75ng模板DNA,0.4μmol·L-1引物,0.750 mmol·L-1 dNTP,1.5 U Taq DNA聚合酶,2.0mmol·L-1 MgCl2,2.0μL 10×PCR缓冲液。     

番茄ISSR-PCR反应体系的优化与验证

研究番茄ISSR-PCR反应体系中主要因子TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板的浓度及各引物的退火温度对扩增结果的影响,建立番茄ISSR- PCR反应的优化体系,为ISSR 技术在番茄分子辅助育种应用提供参考。实验确定番茄ISSR-PCR 20 μL反应体系为：2.0 μL 10×PCR缓冲液,0.3 μmol/L引物,50 ng模板DNA,0.5 mmol/LdNTP,2 U TaqDNA聚合酶,各引物最佳退火温度有所不同。     

峨眉含笑基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

以峨眉含笑嫩叶为材料,研究了峨眉含笑基因组DNA提取方法及RAPD反应条件。结果表明:采用改良的CTAB方法,提取的DNA质量较高,适宜于RAPD-PCR分析。在25μL反应体积中,RAPD分析的优化反应体系为:1.5 mmol/L Mg2+、0.8 mmol/L dNTP、240 nmol/L随机引物、80 ng DNA、1.0 U Taq DNA聚合酶。     

大花君子兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以大花君子兰为材料研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对君子兰ISSR扩增结果的影响,并对影响PCR反应体系的主要成分及退火温度进行筛选和优化,确立了适合君子兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Mg2+为2.0 mmol/L,模板DNA用量为50 ng/μL,Taq酶0.4 U,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,引物浓度为0.4 mmol/L。筛选出了13个适宜君子兰遗传分析的ISSR引物,确定最适宜退火温度为52~56℃。     

单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以单雌蓖麻提取的基因组DNA为材料,采用单因子试验方法,分别研究了Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶以及模板DNA用量5种因素对ISSR-PCR反应的影响;建立了适合单雌蓖麻IS-SR-PCR扩增的反应体系,即在20μL反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL(Mg2+free),模板DNA 20 ng,2.0mmol/L MgCl2,引物浓度1.0μmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U。     

麻疯树cpSSR标记技术的建立与体系优化研究

[目的]建立麻疯树cpSSR—PCR反应的最佳反应体系。[方法]对影响麻疯树cpSSR—PCR反应体系的5个因素（细DNA聚合酶、DNA模板、Mg2＋、dNTP、引物）进行优化试验,筛选各反应因素的最佳水平。[结果]20山反应体系各组分的最合适浓度分别为10XBuffer、2．00mmoL／LMg2＋、2U／μlTagDNA聚合酶、0．2mmol／LdNTP、0．2μmol／L引物、35ng／μlDNA模板。[结论]最佳的退火温度为52℃：该反应体系的稳定性和可重复性均较好。     

葛属植物ISSR-PCR扩增条件的正交优化

利用正交试验设计法L9(34),从引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度和dNTP浓度4种因素3个水平,对葛资源ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对PCR反应的退火温度进行梯度筛选。结果表明,25μL最佳的葛资源ISSR-PCR反应体系是:1×PCR buffer、0.20 mmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、2.5 mmol/L Mg2+和0.5 U TaqDNA聚合酶,引物UBC809的最佳退火温度为57.9℃。     

香蕉ISSR反应体系的建立

以35份香蕉品种为材料,采用正交设计L25(56)对PCR反应中的DNA质量浓度、TaqDNA聚合酶用量、Mg2+浓度、引物浓度、退火温度及甲酰胺浓度等6个因素在5个水平上进行了优化试验.建立了稳定的、可重复的香蕉ISSR最佳反应体系和PCR扩增参数.确定在25μL的反应体系中,DNA模板质量浓度为0.8 ng/μL,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.2μmol/L,Taq酶为1.25 U,退火温度为52℃.     

均匀设计与正交设计优化海岛棉RGA-PCR体系

采用均匀设计和正交设计对影响海岛棉RGA体系Mg2+、dlgIP、引物以及Taq DNA聚合酶浓度等因素进行了均匀优化和正交优化试验后建立了适合于海岛棉RGA的反应体系:在10μL反应体系中1×Buffer,Me2+2.5 mmol/L,dNTP0.25 mmol/L,引物浓度1.0 μmmol/L,Taq酶0,375 u/μL,DNA 20 ng.各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以Mg2+浓度影响最大,Taq DNA聚合酶的影响最小.运用该体系对海岛棉材料进行验证,证明该体系稳定可靠,并从22对RGA引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的10对引物.这一体系的建立及多态性引物的筛选为今后利用RGA标记技术进行海岛棉枯萎病研究提供了科学依据.     

茶藨子总DNA提取及ITS-PCR体系的优化

利用Tiangen DP305试剂盒对茶藨子(Ribes L.)总DNA进行提取,应用单因子试验分析了DNA模板、dNTPs、引物和Taq酶对ITS-PCR扩增结果的影响,并建立了茶藨子ITS-PCR扩增反应的优化体系,最优反应体系为:25μL体系中,10×PCR buffer 1μL、Mg2+0.4 mmol/L、引物浓度0.5μmol/L、dNTP浓度为1 mmol/L、Taq酶的用量1.0 U、DNA模板用量为50 ng。优化后的反应体系可作为茶藨子属植物ITS-PCR的基本反应体系,为进一步开展茶藨子属的分类和系统发育研究奠定基础。     

珍稀濒危竹种筇竹(Qiongzhuea tumidinoda)RAPD反应条件的优化

以宜宾筇竹为材料建立了筇竹RAPD反应优化体系,用于筇竹遗传多样性分析,以改进的CTAB法提取筇竹叶片总DNA,分别测试了镁离子浓度、dNTP浓度、引物浓度、模板DNA含量、DNA聚合酶量对反应结果的影响。通过对各因子的组合比较,建立了筇竹RAPD反应优化体系:20μL PCR反应体积,10×Taq酶配套缓冲液(2μL);1.25 U Taq酶;75 ng模板DNA;45 ng引物;1.88 mmol/L MgCl2;0.19 mmol/L dNTP。     

香榧ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选

以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’基因组DNA为材料,对影响简单序列重复区间扩增?鄄聚合酶链式反应（ISSR-PCR）的Taq酶用量、Mg²⁺浓度、模板DNA用量、磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和引物浓度等进行了优化试验。优化后的香榧ISSR-PCR扩增体系为：总容积20 μL,包括30 ng模板DNA,16.67 nkat Taq酶,0.350 μmol·L -1引物,1.625 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.250 mmol·L^-1 dNTPs,10 × PCR buffer 2 μL。PCR扩增程序：94 ℃变性5.0 min;35个循环：94 ℃变性30 s,退火45 s,退火温度视引物而定,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7.0 min,4 ℃保温。在此基础上,从77个ISSR引物中筛选出34个适合香榧ISSR分析的引物,且通过梯度PCR确定了各自最适的退火温度。研究结果为香榧遗传图谱构建打下了基础。图4表1参12