怀地黄SRAP分子标记优化体系的建立

为了建立适宜怀地黄的SRAP反应体系,以22个不同类型的怀地黄品种为材料,研究了PCR反应体系的主要成分对SRAP扩增结果的影响.对SRAP反应体系中的DNA模板浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度以及dNTP浓度进行了探索,确立的适合怀地黄SRAP反应的体系为:在25 μL的反应体系中,模板DNA20 ng、2.5 mmol·L-1 Mg2+、0.32 μmol·L-1的上下游引物、0.30 mmol·L-1的dNTPs以及2.5U Taq酶.并利用该反应体系对怀地黄22个不同品种进行了SRAP反应,发现不同品种间的DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠,可以用于怀地黄的分子标记研究.     

水稻SSR-PCR技术反应体系的优化

以水稻为材料,研究了SSR-PCR反应体系中Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA浓度时水稻SSR扩增效果的影响.结果表明,在试验设计范围内,Mg2+和dNTP浓度对扩增影响较大,引物浓度在1.6～3.0μmol·L-1范围内对扩增影响较小,TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度对扩增影响也很小.确定的最佳反应体系为20μL,Mg2+浓度为1.75 mmol·L-1、dNTPs为0.20 mmol·L-1、引物为2.4 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶为0.75U、模扳DNA为45ng.     

苜蓿基因组总DNA提取及RAPD反应条件优化

采用CTAB改良法,从苜蓿成熟叶片中提取到高质量、高纯度的DNA.对RAPD反应程序的重要参数进行摸索和优化试验,建立的适合苜蓿RAPD分析应用的体系组成为:反应液总体积25μL,模板DNA浓度135 ng·μL-1,10×缓冲液浓度2.5 mmol·L-1,10碱基引物浓度15pmol,TaqDNA聚合酶1U,dNTP浓度1.5 mmol·L-1,Mg2 浓度2.5 mmol·L-1.     

桃SRAP-PCR反应体系建立及与半矮生型相关标记的研究

试验采用常规CTAB法提取了桃叶片基因组DNA,并以半矮生型桃基因组DNA为模板,通过对影响扩增结果的Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度及引物浓度的梯度试验,对桃SRAP-PCR反应体系进行了优化.结果表明:桃SRAP-PCR的最佳反应体系为DNA模板25～30ng,10×Buffer2μL,Mg2+浓度2.5mmol·L-1,dNTP浓度0.25mmol·L-1,Taq酶1.1U,引物浓度0.3μmol·L-1.通过BSA法建立半矮生型和普通型基因池,从266对SRAP引物中筛选出21对与桃半矮生性状相关的SRAP标记,并通过对18个个体的扩增检测,发现了1个与半矮生性状相关的标记.     

草莓RAPD反应体系的优化

以草莓幼叶为试材,进行RAPD反应扩增体系的优化.对模板、dNTP、引物、MgCl2和Taq DNA聚合酶等条件进行优化.结果表明,在20 μL的反应体系中,以DNA模板用量25 ng,引物用量为0.15 μmol·L-1,dNTP用量为120μmol·L-1,Mg2+用量为2.5 mmol·L-1,Tap DNA聚合...     

思茅松RAPD反应体系的优化

从思茅松幼苗的嫩叶中提取基因组DNA作为模板,运用均匀设计方法,获得思茅松RAPD扩增反应的优化体系:20μL反应体系中,DNA模板用量50ng,引物浓度0.5mmol.L-1,Mg2 浓度4mmol.L-1,TaqDNA聚合酶用量2.0U,dNTP浓度0.75mmol.L-1。用19条引物进行验证,证实该体系重复性好、结果稳定。     

苦楝SRAP-PCR反应体系的建立及优化

【目的】应用SRAP技术对苦楝Melia azedarach遗传多样性、种质资源鉴定等开展研究,对苦楝SRAP-PCR体系中的模板DNA、d NTPs、Mg2+、引物和Taq DNA聚合酶5个组分浓度进行优化,建立适合苦楝的SRAP-PCR反应体系.【方法】采用单因素试验对反应体系中的5个因素分别设置8个浓度梯度水平,确定浓度范围后进行L16(45)正交试验设计,并对结果进行打分,确定优化体系.【结果和结论】SRAP对苦楝DNA浓度的要求不高,有一个较宽的浓度适宜范围;d NTPs在0.1~0.2 mmol·L-1范围内,能扩增出条带基本相同的清晰谱带;Mg2+为2.0mmol·L-1左右时扩增条带较清晰且数量多;引物介于0.48~0.64μmol·L-1均能扩增出带型基本保持一致且清晰的谱带;Taq DNA聚合酶在0.50~2.00 U范围内可以得到清晰的带型.根据正交试验设计16个处理的得分,确定优化的反应体系为:模板DNA 30 ng、d NTPs 0.125 mmol·L-1、Mg2+2.25 mmol·L-1、引物0.48μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.75 U,反应总体积25μL.     

山核桃SSR反应体系优化

优化SSR反应体系是山核桃SSR遗传图谱构建的基础.通过对PCR反应中Taq聚合酶用量、dNTP浓度、引物浓度、Mg2 浓度和模板DNA量的组合试验,确定了山核桃SSR的最佳反应体系,即在30μL反应体系中,含600 ng模板DNA,1×PCR Buffer,2.0UTaq聚合酶,0.22mmol/L dNTP,1.0 mmol/L Mg2 ,0.13μmol/L引物.     

龙眼SRAP反应体系的建立和优化

为获得最佳的龙眼SRAP反应体系,采用分步优化的方法对影响龙眼SRAP-PCR反应的模板DNA用量、Me2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量等进行了研究.确立了适合龙眼SRAP分析的反应体系,即体系总体积25 μl,包含1×PCR Buffer,Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTPs 0.5 mmol/L,引物0.3 μmol/L,模板DNA 10 ng,TaqDNA聚合酶1.5 U.结果表明,该体系能很好地满足龙眼基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记应用于龙眼遗传研究是可行的.     

乌药ISSR扩增条件的优化

为了确保ISSR分析的可靠性和重复性,有必要进行ISSR-PCR反应体系的优化.以浙江省天台山乌药(Lindera aggregata)自然种群随机个体的基因组DNA为研究对象,通过对反应体系中的Mg2 浓度、dNTP浓度、模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量、BSA浓度、引物用量进行筛选和优化,得出了适用于乌药ISSR分析的扩增条件:10μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液(200 mmol·L-1 Tris·HCl,PH 8.8,100 mmol·L-1 KCl,1%Triton X-100,100 mmol·L-1(NH4)42S04,20 mmol.L-1MgCl2),0.5U Taq DNA聚合酶,10 ng模板DNA,10 pmol引物,0.4mmol.L-1dNTP.利用优化反应体系从100个ISSR引物中筛选出12个重复性好、稳定性高的引物对20个乌药个体的DNA进行扩增,共得到142个位点,其中,102个为多态位点,多态位点百分率为71.83%,Nei指数为0.284 3,Shannon信息指数为0.415 3,乌药的遗传多样性处于较高水平.     

七筋菇植物ISSR-PCR反应体系研究

为建立适宜于七筋菇Clintonia udensis Trautv.et Mey.ISSR-PCR分析的扩增体系,确定引物适宜的退火温度,利用正交试验设计,从Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶单位、引物浓度4种因素4个水平,对七筋菇ISSR-PCR反应体系进行优化.结果表明,根据Tm-5℃±5℃设定引物的退火温度梯度,确定出不同引物的最适退火温度.对引物873来说,其最适退火温度为53℃.按照正交试验设计,测试不同引物各因子之间在不同水平的组合情况,确定不同引物的最佳组合体系.引物897在第10组合反应最佳即3.0 mmol · L-1Mg2+;0.2mmol · L-1dNTP;0.1μL Taq DNA聚合酶; 0.2μmol · L-1引物浓度.确定10μL的反应体系中,Mg2+为2.5～3.0mmol · L-1,dNTP为0.15～0.20mmol · L-1,引物浓度为0.20～0.25μmol · L-1,Taq DNA聚合酶为0.1μL,模板DNA用量为50ng.适宜的退火温度为48～62℃.     

正交设计优化日本落叶松SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对日本落叶松SRAP-PCR反应体系的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶浓度五因素在四个水平上进行优化试验,PCR结果采用统计软件SPSS13.0进行分析,结果表明:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中模板DNA影响最大;筛选得到日本落叶松SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL)为模板DNA浓度为120ng·20μL-1,dNTPs的浓度为0.15mmol·L-1,引物浓度为0.3μmol·L-1,Mg2+浓度为1.5mmol·L-1,Taq酶浓度为0.SU·2μL-1.这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术对日本落叶松遗传多样性的研究奠定基础.     

利用正交设计优化白桦的SSR-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对白桦SSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2 ,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了白桦SSR-PCR反应的最佳体系(20μL):DNA100ng,Mg2 浓度为3mmol·L-1,Taq酶0.5U,dNTP浓度为0.5mmol·L-1,引物浓度为0.4μmol·L-1。对白桦SSR-PCR最佳反应体系进行了梯度退火温度,得到的最佳退火温度为59.9℃。     

文冠果DNA提取及RAPD和ISSR反应体系构建

为研究文冠果种质遗传多样性,以新疆奇台文冠果自然栽培居群的48个单株为材料,采用改良CTAB法提取文冠果基因组DNA,并对其RAPD和ISSR反应体系进行了优化。研究结果表明:文冠果的RAPD最适反应体系为:PCR扩增总体积为20μL,包含30ng的模板DNA,10×PCR buffer 2μL,2.0 mmol·L-1Mg2+,0.1mmol·L-1dNTP和Taq DNA聚合酶1U;ISSR最适反应体系为:PCR扩增总体积为20μL,包括30ng的模板DNA,10×PCR buffer 2μL,2.5mmol·L-1 Mg2+,0.2mmol·L-1dNTP和Taq DNA聚合酶1U。在最适反应体系下,RAPD和ISSR分析具有良好的稳定性和可重复性。     

扁玉螺ISSR-PCR反应体系的建立及其优化

以扁玉螺基因组DNA为材料,分析了Mg2 ,dNTP、Taq DNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响,建立了一套适合扁玉螺的ISSR-PCR反应体系.该反应体系包括:2.0mmol·L-1的Mg2 ,0.25 mmol·L-1的dNTP,0.8 U的Taq DNA聚合酶,0.2 μmol·L-1的ISSR引物和40 ng模板DNA.利用优化后的反应体系,从30条ISSR引物中筛选出13条扩增效果较好的引物,为进一步利用ISSR标记研究扁玉螺的遗传多样性奠定了基础.     

正交设计优化广藿香基因组SRAP扩增体系的研究

以改良CTAB法提取的广藿香叶片DNA为模板,采用正交试验设计,从Mg2+、dNTP、引物浓度和DNA聚合酶4因素3水平,对SRAP扩增效果进行研究,比较不同模板DNA浓度对PCR扩增的影响,确立适合广藿香SRAP-PCR反应的最佳体系.利用SRAP-PCR优化体系对引物进行了全面筛选.结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响,总体积20μL的SRAP-PCR优化反应体系中含有:2 μL 10×buffer、20 ng模板DNA、1.5 mmol/L Mg2+、250 μmol/L dNTP、0.3 μmol/L Primer、Taq DNA聚合酶1.5 U.运用该体系对部分广藿香单株进行检验,证明该体系稳定可靠;以此体系为基础从90对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物18对.     

一品红ISSR反应体系的建立与优化

运用L16(45)正交设计对一品红ISSR反应的5个因素(DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、TaqDNA酶浓度)在4个水平上进行优化试验,通过不同反应体系扩增效果比较,建立了优化的一品红ISSR反应体系:50μL的PCR体系中含有DNA模板100 ng、Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTPs 0.20 mmol·L-1、引物300 pmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0 U.     

濒危植物珙桐ISSR-PCR反应体系的建立

以珙桐叶片为材料,通过单因子试验分别研究了退火温度、TaqDNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2 浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,建立了适宜于珙桐ISSR分析的扩增体系,即25μl的反应体系中:模板DNA20 ng,Mg2 1.5 mmol/L,引物0.6μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U。     

基于正交设计的畜禽废水处理中活性污泥DNA的16S rDNA－PCR扩增体系

用SBR反应器处理畜禽废水,提取其中好氧活性污泥总DNA,比较3种物理破壁方法对DNA质量的影响,同时选择4个因素(DNA模板,Mg2 ,dNTP,引物)对16S rDNA-PCR反应体系进行正交优化,并确定最适退火温度.结果表明,反复冻融法的DNA纯度大于玻珠振荡法和摇床振荡法,可不经纯化直接扩增;DNA浓度对PCR结果影响最大,Mg2 和dNTP浓度的影响次之且程度相同,引物浓度影响最小;最佳PCR扩增体系(25 μL)的组成为:模板DNA 0.32 μg,dNTP 200 μmol·L-1,Mg2 1.5 mmol·L-1,引物1.0μmol·L-1,Taq DNA聚合酶0.2U,且最适退火温度为56.5℃.     

单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以单雌蓖麻提取的基因组DNA为材料,采用单因子试验方法,分别研究了Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶以及模板DNA用量5种因素对ISSR-PCR反应的影响;建立了适合单雌蓖麻IS-SR-PCR扩增的反应体系,即在20μL反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL(Mg2+free),模板DNA 20 ng,2.0mmol/L MgCl2,引物浓度1.0μmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U。