正交设计优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系

[目的]优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系,为大旗瓣凤仙遗传多样性分析提供技术参考.[方法]利用正交试验设计对大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA)4水平进行优化分析,并在此基础上对PCR反应过程中的退火温度进行筛选.[结果]建立了大旗瓣凤仙ISSR-PCR的优化反应体系,即在25.0 μL反应体系中含1×PCR Buffer、Mg+ 1.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、TaqDNA聚合酶0.75~1.00 U、模板DNA 100 ng.通过该体系可以筛选出6条对大旗瓣凤仙种群扩增效果较好的引物.[结论]优化的ISSR-PCR反应体系具有较高的稳定性,可用于大旗瓣凤仙及凤仙属植物种群的ISSR遗传多样性分析.     

利用正交设计法优化观赏贝母ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计的方法,对观赏贝母ISSR-PCR反应体系的5因素(模板DNA、引物、Mg<'2+>、dNTP、TaqDNA聚合酶的浓度)在4水平上进行优化试验,PCR结果用Mnitab数据处理软件分析,建立的最佳反应体系(20 μL)为:模板DNA 10 ng、引物0.5μmoL/L、Mg<'2+> 2.5 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、Taq DNA聚合酶2.0 U.对观赏贝母IS-SR-PCR最佳反应体系进行了梯度退火试验,得到的最佳退火温度为57.9℃.     

早稻孢囊线虫ISSR反应体系的建立与优化

采用正交设计对早稻孢囊线虫ISSR-PCR反应体系的4因素(Taq酶、模板DNA、dNTPs、引物)在4个用量水平上进行优化试验.结果表明,早稻孢囊线虫ISSR-PCR最佳的反应体系为:在25μL反应体系中,含TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.3 μL、模板DNA 1μL、dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL、引物(10 μmol/L)1 μL、10×PCRBuffer(20 mmol/L Mg2+ plus)2.5 μL.引物UBC887最适退火温度为48℃.优化的早稻孢囊线虫ISSR-PCR的反应体系和程序有较好的重复性和稳定性.     

春兰ISSR-PCR反应体系的优化

以春兰为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模板DNA、dNTPs、MgCl2、primer、TaqDNA聚合酶的浓度及引物退火温度、反应循环数进行了探讨,确立了适合春兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数:在15μL反应体系中含1×buffer,0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,0.3 UTaqDNA聚合酶,20 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2.5 min;94℃变性45 s,48~58℃退火(退火温度随引物不同而定)45 s,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸5 min。     

胡椒ISSR反应体系的建立与优化

旨在构建胡椒(Piper nigrum L.)基因组DNA的ISSR-PCR反应体系,以便为海南胡椒属植物的遗传多样性分析研究打下基础。利用单因素随机试验设计,对胡椒ISSR-PCR反应体系中各组分(TaqDNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、引物和Mg2+)的浓度进行优化,同时筛选ISSR-PCR反应的循环数和最适退火温度。确定了最优的ISSR-PCR反应体系为:总体积20μL,其中Taq DNA聚合酶1.0 U,dNTPs 0.8 mmol/L,引物0.2 mmol/L,Mg2+1.8 mmol/L,模板DNA 50 ng。同时通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度及最佳循环数。胡椒ISSR-PCR最佳反应程序为:95℃预变性5 min;94℃变性30 s,54.9℃(引物834)退火30 s,72℃延伸45 s,共计35个循环,循环结束后72℃延伸7 min,4℃保存。这一反应体系可成功地应用于海南胡椒属植物的遗传多样性分析。     

马褂木ISSR-PCR扩增体系的优化

【目的】建立稳定的马褂木ISSR-PCR扩增体系,为马褂木种群ISSR多样性分析提供技术支持。【方法】采用单因素试验对ISSR-PCR扩增体系中的MgCl2、dNTPs、引物浓度、TaqDNA聚合酶、DNA模板用量和退火温度等主要因素进行筛选优化。【结果】采用试剂盒方法提取马褂木叶片DNA的效果优于改良CTAB法,最优PCR反应体系为：总体积20.0μL中含有10×Buffer2.0μL、MgCl21.8mmol/L、dNTPs0.2mmol/L、引物0.5μmol/L、TaqDNA聚合酶1.00U、DNA模板60ng、退火温度59.1℃。【结论】优化后的马褂木ISSR-PCR扩增体系能够扩增获得清晰、稳定的条带,可满足马褂木种群ISSR多样性分析的要求。     

早熟马铃薯 ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为得出马铃薯ISSR-PCR最佳的反应体系,采用正交试验设计,对rTaq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs和引物进行5因素4水平筛选.结果表明,马铃薯ISSR-PCR的最佳反应体系为:总体积25 μL的反应体系中含有rTaq DNA聚合酶0.5 U、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、模板DNA用量为75 ng、dNTPs浓度为200 μmol/L、引物浓度为0.8 μmol/L.这些因素对PCR反应的影响大小顺序为Mg2+浓度＞rTaq DNA聚合酶用量＞dNTPs浓度=引物浓度＞模板DNA用量.应用该最佳反应体系对39条ISSR引物进行筛选,得出15条条带清晰、条带数多、重复性好的引物.并通过退火温度梯度试验得出筛选引物的最佳退火温度.     

濒危植物珙桐ISSR-PCR反应体系的建立

以珙桐叶片为材料,通过单因子试验分别研究了退火温度、TaqDNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2 浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,建立了适宜于珙桐ISSR分析的扩增体系,即25μl的反应体系中:模板DNA20 ng,Mg2 1.5 mmol/L,引物0.6μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U。     

青海云杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]确定适应青海云杉ISSR-PCR反应的最佳反应体系。[方法]以青海云杉（Picea crassifolia kom.）为材料,对影响其ISSR—PCR扩增结果的各因素（Mg^2＋、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、引物、退火温度）进行筛选和优化。[结果]青海云杉ISSR—PCR最佳反应体系为在20山反应体系中包含1μl 10×buffer,1．5mmol／L的Mg^2＋ 0．2mmol／L的dNTPs,TaqDNA聚合酶1．0U,模板DNA 40ng,引物0．6μmol／L。对青海云杉ISSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验发现,引物UBC818的最适退火温度为54．2℃,且最适退火温度因引物而异。[结论]该优化ISSR．PCR反应体系的建立,为今后利用ISSR技术进行青海云杉种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

四倍体菘蓝ISSR-PCR反应体系优化与遗传差异分析

采用单因子试验,研究引物、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶及退火温度对PCR扩增的影响,用其建立优化四倍体菘蓝的ISSR-PCR反应体系,分析不同四倍体菘蓝株系的遗传差异性.结果发现ISSR-PCR最佳反应体系为:在25 μL的反应体系中,引物浓度为0.76 μmol/L,dNTPs浓度为190 μmol/L,MgCl2浓度为200 μmol/L,Taq DNA 聚合酶用量为1.5U,模板DNA浓度为20 ng/μL;确定了不同引物最佳退火温度;菘蓝株系间具有中等偏高的遗传差异性,多态性条带达58.22％.表明采用单因子试验可以快速建立ISSR-PCR反应体系,可用于菘蓝遗传差异性分析.     

毛白杨ISSR反应体系的建立及优化

为应用ISSR技术开展毛白杨遗传变异分析、辅助育种、品种鉴定、系统进化等研究,以(GTG)6为引物,通过单因子实验分别研究了退火温度、引物浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量对毛白杨ISSR-PCR反应的影响,建立并优化了适宜于毛白杨ISSR分析的扩增体系: 20 μL PCR反应体系,1×Taq DNA酶缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl, 0.1% Trion X100, pH 9.0),1.5 mmol/L MgCl2,1.0 U Taq酶,10 ng模板DNA,0.2 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTP. 引物(GTG)6的最适退火温度为61℃.      

适于长竹蛏的ISSR反应体系的优化

[目的]以长竹蛏基因组DNA为模板,探讨利用简单重复序列区间分子标记技术进行PCR扩增的最优条件。[方法]采用单因素比较试验,分析了Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响。[结果]长竹蛏的ISSR反应体系包括10×Buffer,2.5 mmol/LMg2+,0.25 mmol/L dNTP,0.5μmol/L ISSR引物,0.040 U/μlTaqDNA聚合酶,1.6 ng/μl模板DNA。[结论]优化后的反应体系适于长竹蛏的ISSR-PCR扩增。     

多花黄精ISSR反应体系的建立及正交优化设计

通过对多花黄精ISSR-PCR反应中的Taq酶、buffer(Mg2+)、模板DNA、dNTP以及引物5个关键因素进行了5因素4水平的正交设计试验,确立了适合多花黄精基因组DNA的稳定性强、扩增最多数量谱带的ISSR-PCR最优反应体系,即25μL的反应体系中含有1.0 U Taq DNA聚合酶,3.5 mmol.L-1buffer(Mg2+),80 ng模板DNA,0.08 mmol.L-1dNTP和0.16μmol.L-1引物。采用建立的多花黄精ISSR-PCR最佳反应体系进行退火温度梯度试验,确定了引物UBC841的最适退火温度为54.8℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立为今后利用ISSR技术进行黄精种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了良好的技术基础。     

青钱柳ISSR-PCR反应体系的优化

采用改进的SDS法提取青钱柳基因组DNA,测试青钱柳ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试了模板DNA、Mg2+、dNTP、BSA、引物\Taq酶6个因素对青钱柳ISSR扩增的影响。结果表明:合适的退火温度为56.3℃;适宜的扩增体系为:10μlPCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液浓度为(10 mmol/LTris.HCl,pH值9.0,浓度为50 mmol/LKCl,0.1%Triton X-100),12 ng模板DNA,浓度为1.5 mmol/LMgCl2,浓度为1.0 mmol/L4×dNTP,1mg/ml BSA,15 pmol引物,0.75 UTaq酶。     

菊芋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用正交试验设计的方法,从Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度4因素对菊芋ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度及退火温度进行梯度检测。结果表明:菊芋20μl最佳反应体系包括10×PCR buffer,200μmol/L dNTP,0.5μmol/L引物,1.5 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶和50 ng模板DNA。这一优化系统的建立,将为菊芋种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。     

大花君子兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以大花君子兰为材料研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对君子兰ISSR扩增结果的影响,并对影响PCR反应体系的主要成分及退火温度进行筛选和优化,确立了适合君子兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Mg2+为2.0 mmol/L,模板DNA用量为50 ng/μL,Taq酶0.4 U,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,引物浓度为0.4 mmol/L。筛选出了13个适宜君子兰遗传分析的ISSR引物,确定最适宜退火温度为52~56℃。     

葛属植物ISSR-PCR扩增条件的正交优化

利用正交试验设计法L9(34),从引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度和dNTP浓度4种因素3个水平,对葛资源ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对PCR反应的退火温度进行梯度筛选。结果表明,25μL最佳的葛资源ISSR-PCR反应体系是:1×PCR buffer、0.20 mmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、2.5 mmol/L Mg2+和0.5 U TaqDNA聚合酶,引物UBC809的最佳退火温度为57.9℃。     

正交优化法建立沙打旺ISSR-PCR最佳反应体系

根据正交试验设计的原理,设计了探索性正交试验和细调性正交试验来确定沙打旺ISSR-PCR体系中各成分的浓度。得到既稳定又能扩出最多条带的适合沙打旺的ISSR-PCR最佳反应体系,即20μl的反应体系中含有1×buffer,dNTP 0.2 mmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.3μmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,DNA模板2.5 ng/μl。然后对沙打旺ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为54.1℃。这一最佳体系的建立为今后利用ISSR标记技术,研究沙打旺的遗传多样性提供了标准化程序。     

分蘖洋葱ISSR-PCR扩增体系的建立

以分蘖洋葱幼嫩叶片DNA为试材,采用单因素试验,对ISSR-PCR扩增体系中的退火温度、模板DNA量、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶含量以及引物浓度等各因素进行优化.结果表明,在反应体系为25μL反应液中,包含DNA模板40 ng(2μL),10×PCR Buffer 3μL,Mg2+(2.5 mmol·L-1)2μL,dNTPs(2.5 mmol·L-1)3μL,引物(5 mmol·L-1)3μL,Taq酶(5 U·μL-1)0.4μL,退火温度为56℃时,分蘖洋葱ISSR-PCR扩增获得最佳效果,初步建立分蘖洋葱叶片最佳ISSR-PCR扩增体系,为ISSR分子标记技术应用于分蘖洋葱种群遗传多样性分析、遗传图谱构建、核心种质资源保存利用等奠定分子生物学的理论基础和技术支撑.