兜兰ITS-PCR反应体系的建立及优化

为优化兜兰ITS-PCR反应体系,以兜兰属植物为试材,用改进的CTAB法提取总DNA,并采用单因子试验设计,对影响兜兰DNA ITS-PCR扩增反应的主要因素即Taq DNA聚合酶的用量、Mg2-浓度、dNTP浓度、引物退火温度、模板DNA用量和引物浓度等进行优化研究,建立兜兰最佳ITS扩增反应体系.结果表明:最佳反应体系为25 μL体系中,添加10×PCR buffer 2.5 μL、Taq DNA酶1.25U、Mg2+ 1.5mmol/L、dNTP 0.15 mmol/L、引物0.6μmol/L和模板DNA 40 ng,反应程序为94℃预变性4 min,1个循环;94℃变性30 s,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸7 min后终止反应,4℃保存.利用此反应体系可得到预期大小的ITS基因片段.     

利用正交试验设计优化桂花的SSR-PCR体系

以潢川金桂DNA为SSR-PCR扩增模板,采用L_(16)(4~5)正交设计对Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度以及引物浓度在4个水平上进行了优化,建立了桂花SSR-PCR反应的最佳体系,即在10μL反应体系中,不同成分的最佳含量为Taq酶0.2 U、Mg~(2+)3.0 mmol/L、模板DNA 40 ng、dNTPs 0.60 mmol/L、引物0.8μmol/L。应用最佳体系对引物Of P50进行退火温度的优化,得到最适退火温度范围为60~62℃。     

牡丹SRAP反应体系的建立及正交设计优化

采用L16(45)正交试验设计,对牡丹SRAP(sequence related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)反应体系中的Mg2+浓度、Taq聚合酶、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度5因素4水平正交优化,建立了适合于牡丹基因组的SRAP-PCR优化扩增反应体系,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs为0.3 mmol/L,Taq酶1.5 U,引物为0.4μmol/L,模板DNA 1.0 ng/μL,总体积20.0μL。     

橡胶树SRAP体系优化及其PCR引物组合的筛选

为橡胶树遗传多样性分析及遗传图谱的构建奠定基础,分析引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、模板DNA用量、Taq酶用量等因素对SRAP-PCR扩增反应的影响。结果表明,橡胶树SRAP-PCR的适宜扩增反应体系(20μL)为:引物0.2μmol/L,Mg2+2.0mmol/L,dNTPs 0.20mmol/L,模板DNA50ng,Taq酶0.5U。利用该体系从400对引物组合中初筛出28组多态性好的引物组合,获得250条清晰带,多态性比率为62.8%。     

盾叶薯蓣ISSR-PCR扩增条件研究

以盾叶薯蓣的叶片制备ISSR-PCR DNA 模板.通过单因子试验分别研究了模板DNA质量和浓度、Mg2 浓度、Taq酶用量、dNTPs浓度以及退火温度对盾叶薯蓣ISSR-PCR扩增的影响,建立了适宜于盾叶薯蓣的ISSR反应体系和扩增参数,即15μL反应体系中包括:20 ng/L模板DNA,1×Taq酶缓冲液,1.0 U Taq聚合酶,2.5 mmol/L MgCl2,0.2 μmol/L引物和0.3 mmol/L dNTPs.并从46个ISSR引物中筛选出10个带纹清晰、多态性丰富的引物,并确定了这些引物的适宜退火温度.     

蝴蝶兰SRAP反应体系的建立与优化

以蝴蝶兰嫩叶提取的DNA为材料,蝴蝶兰SRAP反应体系中的重要参数Mg2＋、Taq酶、模板DNA及随机引物,建立了一套适合蝴蝶兰基因扩增的SRAP反应体系：25μL的反应体系中Mg2＋浓度为2.0mmol/L,Taq酶1.0U,DNA模板40ng,上下游引物0.8mmol/L。该体系扩增条带清晰,重复性好,有望在蝴蝶兰属植物的遗传育种研究中运用。     

褐苞薯蓣ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过单因素考察结合正交试验的方法,基于反应体系中Taq DNA聚合酶量、DNA模板用量、dNTPs浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度等因素对简单重复序列间扩增(ISSR)反应体系进行优化。结果表明,褐苞薯蓣ISSR-PCR的20μL最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1. 875 U,DNA模板量52. 5 ng,d NTPs浓度0. 25 mmol/L,引物浓度0. 437 5μmol/L,Mg~(2+)浓度1. 5 mmol/L,10×Taq Buffer 2. 0μL,其余用dd H_2O补齐。     

甜柿SSR扩增反应体系的建立

本试验采用正交试验设计法,对"阳丰"甜柿SSR-PCR体系中DNA模板浓度、MgCl2浓度、dNTPs浓度、引物、Taq酶用量等进行了优化,通过琼脂糖凝胶电泳对谱带进行分析,结果表明体系10为最佳体系:20μL扩增反应体系中,25mmol·L-1 MgCl2溶液1.4μL,10 mmol·L-1 dNTPs混合液0.4μL,10 mmol·L-1引物1.1μL,5U·μL-1 Taq酶液0.4μL,10ng·μL-1 DNA溶液4.0μL。所有参试因素中Taq酶对"阳丰"甜柿SSR-PCR扩增结果影响最大,dNTPs对PCR结果影响最小。     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

姜黄属SRAP反应体系的优化与建立

对姜黄属SRAP反应体系进行了Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物及模板DNA浓度等方面的优化,优化后的条件为:反应总体系为26.5μL,包括DNA20 ng、Mg2+ 2.5 mmol/L、dNTPs 0.05 mmol/L、Taq酶0.5 U、引物7.5 μmol/L.     

月季ITS反应体系的优化

以古老月季品种‘玉玲珑'为试材,利用CTAB法对月季进行总DNA提取,对其PCR扩增条件中的主要因素进行了多梯度的优化,总反应体系为25μL,其中引物浓度为0.4μmol/L、Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L、dNTP为0.2 mmol/L、Taq酶用量为1.0 U、DNA模板用量为70 ng.利用该优化体系对部分月季品种和野生种进行PCR扩增和电泳检测,扩增条带清晰,结果稳定,测序结果理想,表明该体系适用于月季的ITS序列分析.     

青钱柳ISSR-PCR反应体系的优化

采用改进的SDS法提取青钱柳基因组DNA,测试青钱柳ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试了模板DNA、Mg2+、dNTP、BSA、引物\Taq酶6个因素对青钱柳ISSR扩增的影响。结果表明:合适的退火温度为56.3℃;适宜的扩增体系为:10μlPCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液浓度为(10 mmol/LTris.HCl,pH值9.0,浓度为50 mmol/LKCl,0.1%Triton X-100),12 ng模板DNA,浓度为1.5 mmol/LMgCl2,浓度为1.0 mmol/L4×dNTP,1mg/ml BSA,15 pmol引物,0.75 UTaq酶。     

利用正交设计优化芦笋SRAP反应体系

以芦笋（Asparagus offinalis L．）为材料,对影响SRAP—PCR扩增结果的因素dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2＋、引物、模板DNA进行了正交优化设计的研究。结果表明,适合芦笋SRAP—vcR析的最佳反应体系：20μL的反应体积中包括0．2mmol／LdNTPs0．4gL;1UTaqDNA酶1．0gL;1．5mmol／LMg2 1．2μg;上下引物各30ng,每个引物O．5此;60ng模板DNA1．1.0μL;10Buffer2．0凼无菌双蒸水13．4此。为今后利用SRAP标记技术研究芦笋的遗传多样性奠定基础。     

小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化（摘要）

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系。[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16（45）对小麦SRAP-PCR反应体系中的5因素（Taq聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTPs、引物）在4个水平上进行优化试验。[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系影响的大小顺序为：Mg2＋〉Taq聚合酶〉dNTPs〉模板DNA〉引物;优化的小麦SRAP-PCR体系为：在20μl反应体系中,包括10×PCR buffer2.0μl、Mg2＋2.0mmol/L、Taq聚合酶2.0U、dNTPs0.2mmol/L、模板DNA40ng、引物0.6μmol/L。[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础。     

草莓RAPD反应体系的优化

以草莓幼叶为试材,进行RAPD反应扩增体系的优化.对模板、dNTP、引物、MgCl2和Taq DNA聚合酶等条件进行优化.结果表明,在20 μL的反应体系中,以DNA模板用量25 ng,引物用量为0.15 μmol·L-1,dNTP用量为120μmol·L-1,Mg2+用量为2.5 mmol·L-1,Tap DNA聚合...     

部分柿属植物TRAP标记反应体系的建立与引物筛选

为了建立柿属植物目标区域扩增多态性(TRAP)标记技术体系,对影响TRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、固定引物和随机引物浓度比5个因素进行了优化。确定优化的反应体系为:模板DNA 40 ng,buffer 1×,Mg2+1.4 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,固定引物和随机引物浓度比为11∶1,Taq酶0.5 U,反应总体积为15μL。利用柿属植物EST数据库信息设计锚定引物10条,与11条随机引物组合共110对引物。利用这些引物对柿属植物6个基因型进行TRAP-PCR扩增,其中84个引物组合能扩增出清晰条带,占引物总量的76.36%;36个引物组合表现出良好的多态性扩增,并在20份柿属植物中进行了引物验证。     

玉米品种真实性鉴定中SSR技术体系的优化

[目的]优化玉米品种真实性鉴定中的SSR技术体系。[方法]以11份玉米骨干自交系为材料,通过对影响SSR扩增质量的Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶的浓度等因素进行优化和比较,建立了适于玉米品种真实性鉴定的SSR标记技术体系,并以5个玉米杂交种为例,验证该体系在玉米杂交种真实性鉴定中的可行性。[结果]Mg2+浓度为2.5 mmol/L时,扩增效果最佳。dNTPs浓度为0.3 mmol/L时,扩增效果最好。引物浓度为0.2μmol/L较为适宜。TaqDNA聚合酶浓度为1.0 U时,扩增效果较好。优化后的PCR反应体系为:1×PCR缓冲液,2.5 mmol/LMg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.2μmol/L正、反向引物,1.0 UTaqDNA聚合酶,40 ng样品DNA,总体积25μl。[结论]该研究优化的SSR技术体系可以有效地对玉米杂交种进行真实性鉴定。     

华山松SRAP-PCR反应体系的优化

为建立华山松SRAP-PCR反应体系,研究先采用L16(45)正交设计对影响华山松SRAP反应的5个因子(DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶)在4个水平上进行优化试验。结果表明:各因素对SRAP反应的影响依次为:Mg2+>dNTPs>Taq酶>DNA模板>引物;对SRAP反应结果影响较大的3个因子(Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度)进行单因素试验;确立华山松SRAP反应最佳体系为:20μL的PCR体系中含有Mg2+2.2mmol/L、dNTPs0.25mmol/L、DNA模板60ng、Taq酶0.8mol/s、引物0.8μmol/L。将该体系用于华山松的SRAP扩增能获得稳定、清晰的多态性条带。     

苦瓜SRAP反应体系的建立与优化

[目的]分子标记技术的快速发展为在DNA水平上估计苦瓜种质的遗传差异提供了更准确、更高效的方法。[方法]采用正交试验设计,对影响苦瓜SRAP反应体系的5种因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq聚合酶及模板DNA)4个水平进行优化筛选。[结果]确立了适合苦瓜SRAP分析的优化反应体系,即1×buffer,1.0 ng/μl模板DNA,1.5 mmol/L Mg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.5μmol/L引物,0.075 U/μlTaq聚合酶,总体积20μl。[结论]优化的SRAP-PCR反应体系的建立为利用SRAP技术进行苦瓜种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。