苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

重组枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的纯化和性质研究

研究嗜热枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组酶的纯化和性质。该基因序列全长723bp,编码240个氨基酸。根据基因同源性分析,该壳聚糖酶与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的壳聚糖酶前体基因的同源性最高,为98%。粗酶液经Ni-IDA亲和层析得到电泳级纯酶,比活力高达1 051.8U/mg。经测定,该酶反应最适温度为45℃,最适pH为6.0,在40℃和pH 4.5～8.0下稳定。该酶为内切壳聚糖酶,能够高效降解壳聚糖,生成一系列的壳寡糖,在壳寡糖的制备生产方面具有广阔的应用前景。     

浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

将含浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因的重组克隆质粒进行亚克隆,用Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a相连接,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达.蛋白质电泳结果表明在25.0 kD处有表达带,酶活力达60.4 U/mL,为出发菌的30多倍.酶特性研究表明:该酶的最适温度为50℃,最适pH为5.0～7.0;在50℃以下及在不同的pH下(pH 3.0～9.0)处理后较稳定.     

短小芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、表达及其酶特性研究

提取短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)基因组,通过PCR克隆了短小芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因全长序列.结果表明:该基因全长754 bp,ORF为717 bp,编码239个氨基酸,计算分子量为26.98 kD,等电点为6.08.经Blast分析,该序列与地衣芽孢杆菌同源性最高(91%),该基因首次在GenBank上登录(登录号AY164456).在克隆载体上亚克隆基因全长,构建重组表达载体pET-pum,导入大肠杆菌BL 21中表达.SDS-PAGE电泳表明:在27 kD左右有表达带,酶活较低(7.24 U/mL),仅为出发菌酶活的16%,其最适温度为50 ℃左右,最适pH在5左右.     

枯草芽孢杆菌分泌表达极耐热木聚糖酶及其酶学性质

为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B(Gen Bank登录号AY340789)在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,将其转化到枯草芽孢杆菌Bs916中,获得重组枯草芽孢杆菌(Bs916/p XYNB2),并对重组芽孢杆菌分泌表达的极耐热木聚糖酶的酶学性质进行了研究。SDS-PAGE法测定重组枯草芽孢杆菌分泌的蛋白在相对分子质量43 000处有明显的蛋白表达条带。重组木聚糖酶的最适反应p H值为5.0~5.8,重组木聚糖酶的最适反应温度大于或等于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.6~7.8比较稳定,重组木聚糖酶的温度稳定性在90℃下保温2 h后残存酶活83%。可见,生防枯草芽孢杆菌Bs916能有效分泌表达极耐热木聚糖酶,为以后构建多种纤维素和半纤维素在其中的协同表达,拓宽其碳源利用范围奠定基础。     

侧孢短芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BLG4在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达

侧孢短芽孢杆菌G4菌株在侵染线虫的过程中可以分泌蛋白酶,降解线虫体壁,从而帮助细菌侵入宿主体内.在本文中,侧孢短芽孢杆菌的胞外蛋白酶BLG4基因经克隆后插入到改造后的枯草芽孢杆菌表达载体pWT22中,构建重组表达质粒pWT22-BLG4.构建成功的重组质粒通过化学转化法转入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB6000中,转化...     

木薯醇腈酶在枯草芽孢杆菌中的表达及活性检测

醇腈酶(α-hydroxynitrile lyase,HNL)能够催化羰基化合物和HCN立体选择性的加工形成手性醇腈化合物。以含有木薯醇腈酶基因的重组质粒pET28a-HNL为模板,应用PCR扩增得到HNL基因,将其连接到pMD18-T载体中进行测序分析,然后通过Nde I和Xba I2个酶切位点将其连接到枯草芽孢杆菌表达载体pMA5Z2中,获得了含有HNL基因的重组质粒pMA5Z2-HNL,转化蛋白质三缺陷的枯草芽孢杆菌DB1342。SDS-PAGE显示HNL在枯草芽孢杆菌DB1342中获得表达,产物分泌到细胞外,每毫升发酵液中获得了2.108 U的醇腈酶。     

前纳豆激酶原基因温控型表达载体的构建及其表达条件的研究

纳豆激酶(nattokinase,简称NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶,该酶具有强烈溶栓活性.本研究从枯草芽胞杆菌中分离纯化得到基因组DNA作为模板,通过PCR扩增前纳豆激酶原基因,将其克隆到质粒pUC19中,构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌DH5α,测序结果表明,所克隆片段全长1152bp,与GenBank中已报道序列同源性达100％.将目的基因片段与表达载体pBV220连接,构建重组表达质粒pBNK,转化大肠杆菌HB101.采用不同诱导时间、不同诱导温度(40℃、42℃和44℃)诱导表达,结果发现转化菌pBNK6-HB101在LB培养基中经30℃培养,42℃诱导表达7小时目的产物表达量达到最大,约占菌体总蛋白的25.35％,转化菌pBNK6-HB101在不同的培养基(LB和TB)中培养,无明显差异.     

产青霉素G酰化酶工程菌的构建

【目的】构建表达巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶(PGA)的枯草芽孢杆菌工程菌.【方法】首先采用PCR从巨大芽孢杆菌基因组DNA中扩增出长度为2 409bp的PGA编码基因,经琼脂糖凝胶电泳检测及DNA测序验证后,再将其与枯草芽孢杆菌穿梭表达载体PMA5(7.5kb)连接后导入到枯草芽孢杆菌10397中表达,并通过聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳(SDS-PAGE)检验其能否表达.【结果】构建了9.9kb大小的PMA5-PGA重组质粒,经SDS-PAGE验证,青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌10 397中作出表达.基因工程菌在37℃、220r/min培养36h发酵条件下,所产PGA的酶活可达到12.426U/mL,比巨大芽孢杆菌发酵产PGA酶提高了5.26倍.【结论】所构建的枯草芽孢杆菌是青霉素G酰化酶的高产工程菌.     

浸麻芽孢杆菌-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

将含浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因的重组克隆质粒进行亚克隆,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a相连接,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达.蛋白质电泳结果表明在25.0 kD处有表达带,酶活力达60.4 U/mL,为出发菌的30多倍.酶特性研究表明:该酶的最适温度为50℃,最适pH为5.0~7.0;在50℃以下及在不同的pH下(pH 3.0~9.0)处理后较稳定.     

人核糖体40S亚基RPS11蛋白的原核表达和纯化

RPS11是核糖体小亚基40S的组成部分,属于核糖体蛋白S17p家族,由RPS11基因所编码,主要存在于真核生物中。本研究通过PCR扩增RPS11基因,构建pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11原核表达载体。将重组质粒转入E.coli DH5α,序列测定正确后,将其转入E.coli BL21(DE3),加入IPTG诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE分析后,利用亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆RPS11基因,构建了原核表达载体pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11,转化宿主菌E.coli BL21(DE3)中进行了表达。SDS-PAGE分析证实表达目的蛋白正确。通过Ni-TNA和GSH-Sepharose层析柱获得纯化蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

甘露聚糖酶基因Man23在芽孢杆菌WB600中的表达

兼具纤维素酶和半纤维素酶活性的Man23基因(Man23)来自于芽孢杆菌B23,将其连接到质粒pHY-P43上,由强启动子P43来启动Man23的表达,重组质粒pHY-p43-Man23转入蛋白酶缺陷型芽孢杆菌WB600中,表达产物与原体系相比,甘露聚糖酶活力提高了21%,电泳检测得到的蛋白图谱显示目的酶丰度有显著提高,杂蛋白未见大量表达,可见构建的WB600体系适用于Man23基因表达.     

犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其表达产物抗原性鉴定

参考GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA,经RT—PCR扩增得到1572bp的基因片段,将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVN重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5a中,进行鉴定、测序。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVN重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸,与GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列相比同源率达到93．9％～99．1％。Western-blotting分析显示表达产物为84kDa的融合蛋白,可被犬瘟热抗血清所识别,具有良好的抗原性。     

来源于嗜热古细菌Pyrococcus furiosus乳糖酶基因的原核表达及酶学性质分析

以嗜热古细菌Pyrococcus furiosus的基因组DNA为模板,通过PCR克隆获得乳糖酶基因celB。将celB基因插入到表达载体pET．30a（＋）上构建原核重组表达质粒pET-celB,转化大肠杆菌B121,阳性转化子在28％下经IPTG诱导4h后进行SDS．PAGE电泳和酶活性测定,结果表明celB基因在大肠杆菌中获得高效表达,乳“糖酶基因celB表达的乳糖酶蛋白CELB分子质量约为58kDa。CELB是耐高温酶,其酶促反应最适温度为105％,在95％至110％之间热稳定性较好;pH5．0时该乳糖酶水解活力最高,在pH5．0～10．0之间,pH稳定性较好,该酶对金属离子依赖性不强。     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因酿酒酵母表达载体的构建

以重组质粒pBAD-LRCP-126为模板,经PCR扩增获得了PLRV缺失突变CP基因的特异性条带。目的片段与pYES2.1/V5-His/-TOPO的连接产物转化大肠杆菌TOP10F′获得了氨苄青霉素抗性菌落,酶切与DNA测序结果确认了酵母表达载体的正确性,该表达载体命名为pYES-LRCP-126。在30℃,酿酒酵母工程菌株INVSc1(pYES-LRCP-126)经2%半乳糖诱导培养16h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条23kDa的诱导表达的蛋白条带,其大小与预期的重组CP大小相符,表明PLRV缺失突变基因在酵母菌中实现了表达。     

柽柳类锌指基因ThZFL酵母诱饵表达载体的构建及其表达验证

利用PCR技术从柽柳cDNA文库中克隆出ThZFL目的基因序列,连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态,经检验后提取质粒,用BamH I和EcoR I限制性内切酶双酶切pMD18-T-ThZFL载体和pG-BKT7-BD空载体,并将酶切产物胶回收后,用T4 DNA连接酶连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态...     

耐盐基因HAL1的克隆及在原核细胞中的表达

以酵母基因组DNA为模板,采用PCR方法得到耐盐基因HAL1,插入原核表达载体pGEX-4T-1的XhoI和EcoRI酶切位点之间,构建原核表达载体pGEX-HAL1;将该载体转化到大肠杆菌中,重组菌株用IPTG诱导表达,其耐盐性比空白菌株提高50%;SDS-PAGE凝胶电泳结果显示有明显表达的蛋白质条带。     

热纤梭菌内切葡聚糖酶在酿酒酵母细胞表面上展示研究

[目的]对热纤梭菌内切葡聚糖酶进行酿酒酵母细胞表面展示研究,探索降低纤维素酶成本和提高酶活的方法。[方法]通过提取产内切葡聚糖酶的热纤梭菌总DNA,根据热纤梭菌内切葡聚糖酶基因序列和酿酒酵母表面展示质粒载体pYD1上的多克隆位点设计引物,克隆内切葡聚糖酶目的基因,将其连接到酵母表面展示质粒载体pYD1上,构建重组质粒pYD1-CelA,并将其转化入酿酒酵母菌株EBY100中,经诱导表达后,测定表达产物的最适温度和pH,并分析影响其活性的金属离子种类和浓度。[结果]PCR扩增获得1 400bp左右的内切葡聚糖酶CelA基因片段,并成功构建了该基因与酵母表面展示质粒载体pYD1的重组质粒pYD1-CelA。重组质粒转化酿酒酵母菌株EBY100后,在鉴定培养基上测定透明圈的大小得出最佳诱导时间为60 h。表达产物性质的研究结果显示其最适反应温度为50℃,在pH 4.6时酶活性相对较高。[结论]该研究结果为后续对纤维素酶的进一步研究、改造、大量生产及应用奠定了一定的基础。     

pGEX-4T-1-cMC4R原核表达载体的构建与表达

[目的]构建犬MC4R基因编码区的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。[方法]以Beagle犬基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的片段,利用LP Recco PCR克隆技术将目的片段直接重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,BamHI、XhoI酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R转化到E.co-liBL21内,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE检测犬MC4R蛋白的表达。[结果]成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R,经DNA测序证实插入序列与设计基本一致,只有777位碱基T变成了C,这是由于犬MC4R编码区存在的多态性引起,对表达的犬MC4R蛋白序列无影响。大肠杆菌诱导后表达出犬MC4R融合性蛋白。[结论]成功构建犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供帮助。     

Cloning of Porcine Lactoferrin Gene and Construction of Expression System in Recombinant Lactobacillus

Lactobacillus was selected as a bacterial carrier for expression of N-lobe of porcine lactoferrin （PLFN）. A pair of primers was designed with Oligo6.0 and used to amplify PLFN gene. It was in accordance with the characters of translational fusions from gene and expression vector plasmid. A 1 077 bp fragment of the gene from PLF was cloned from mammary gland tissue of the lactating sow on the third day by RT-PCR; the gene was connected with the vector plasmid pPG612.1 and transformed into the host strain JM109. The recombinant expression vector plasmid pPG612-PLFN was created and identified by using plasmid extraction, PCR, restriction enzyme digestion and sequence analysis. The recombinant plasmid was transformed into Lactobacillus casei ATCC393, Lactobacillus plantarum KLDS 1.0344, Lactobacillus paracasei KLDS 1.0652 and Lactobacillus pentosus KLDS 1.0413 by electroporation, and produced the recombinant strains of pPG612-PLFN/L, casei, pPG612-PLFN/L, plantarum, pPG612-PLFN/ L. paracasei and pPG612-PLFN/L, pentosus, respectively. The results indicated that PLFN gene had inserted into the expression vectors and achieved multiple Laetobacillus expression systems. It electes the base for the expression and production of recombinant porcine lactoferrin in Lactobaeillus