拟南芥CYCD3;1基因植物表达载体的构建 及在烟草中的遗传转化分析

为了分析植物D型细胞周期蛋白在细胞周期中的作用,采用PCR方法从拟南芥花序中克隆出At CYCD3;1基因的全长c DNA序列。该基因的开放读码框为1131 bp,预测编码376个氨基酸,蛋白质的分子量为42701.6 Da,蛋白质的等电点为4.89。构建植物表达载体p ROKII-At CYCD3;1,并利用农杆菌介导的叶盘法将外源基因导入野生型烟草中。通过PCR及q RT-PCR检测显示,At CYCD3;1成功插入烟草基因组并在转录水平表达。表型观察显示转基因株系与野生型株系相比主要表现为花冠宽度变大,花瓣和萼片长度变长,果实变大,茎干弯曲,叶片卷曲,根尖细胞变小。综上,拟南芥At CYCD3;1基因的过量表达影响了植物的生长发育。     

小黑杨PsneIF5A2/4基因植物表达载体的构建及在烟草中的转化研究

[目的]研究杨树eIF5A基因的功能,为林木抗性育种研究提供参考。[方法]构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,并对转基因烟草进行分子水平鉴定。[结果]杨树eIF5A基因已经整合入烟草基因组中,且转基因烟草比野生型烟草叶片抗重金属能力提高。[结论]杨树eIF5A基因能促进转基因烟草的抗胁迫能力,为林木抗逆育种机理奠定了理论基础。     

烟草组织的环境扫描电镜观察

以烟草的不同组织为材料,采用改进的环境扫描电镜(ESEM)技术,对烟草的叶表皮、腺毛、花表皮和种子表皮微形态进行了显微观察及拍照。结果表明,改良的环境扫描电镜技术分辨率更高,能更真实地呈现组织的结构特点。同时发现烟草不同组织间细胞形态存在较大差异,一些基因的表达差异也能影响细胞的特征,这为转基因植株的微观性状描述提供了新的研究途径。     

一种简易安全的从农杆菌和酵母中提取RNA的方法研究

[目的]设计一种简易安全的从农杆菌和酵母中提取RNA的方法。[方法]利用Triton X-100和SDS作为裂解液的主要成分,通过热激法裂解菌体,然后进行一系列的抽提、沉淀、洗涤,获得纯净的RNA;并用琼脂糖凝胶电泳及核酸检测仪检测总RNA的纯度、浓度及质量。[结果]该方法能高效裂解菌体,有效防止RNase污染,可以获得高质量的RNA。[结论]该研究成功的得到一种简易、安全提取农杆菌和酵母RNA的方法,为后续的基因表达分析奠定了技术基础。     

小黑杨PsnAP1基因转化烟草的研究

[目的]研究杨树APETALA1基因的功能,为缩短林木育种周期及杨树成花机理的研究提供参考。[方法]以杨树为研究对象,构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,并对转基因烟草进行分子水平鉴定。[结果]杨树APETALA1基因已经整合入烟草基因组中,且转基因烟草比野生型提早开花。[结论]杨树APETALA1基因能促进转基因植株开花,为研究杨树成花机理奠定了基础。     

可用于植物转化的RNAi载体构建方法

利用PCR方法扩增杨树Poptr;CYCD1;1基因的一段内含子序列,并克隆到pROKⅡ载体中,以构建可用于植物特定基因表达干扰的RNAi载体。为了验证载体的效果,构建pCAMBIA-1303载体转化烟草,经检测,转基因烟草能过量表达外源GUS与GFP融合蛋白。把GUS及GFP片段序列连接于RNAi载体,并导入pCAMBIA-1303载体转化烟草。试验结果表明,GUS及GFP干扰序列的导入均能大大降低外源GUS与GFP融合基因的表达。结果说明构建的载体能有效干扰特定基因的表达。     

小黑杨CYCD3;3基因启动子序列分析及其在拟南芥中的表达

通过相关网站及生物信息软件对Poptr:CYCD3;3基因启动子序列进行详细分析,从小黑杨(Populus)叶片总DNA中克隆到2 000 bp的目的片段,构建植物表达载体(p CAMBIA1301-Promoter:CYCD3;3),并利用浸花法转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana);通过抗性筛选和分子检测结果显示,p CAMBIA1301-Promoter:CYCD3;3基因已经整合到拟南芥基因组中。同时对获得的转基因幼苗进行GUS染色并观察,其基因表达模式主要集中在植物分生组织中,由此表明Poptr:CYCD3;3调控CYCD3;3基因在细胞分裂中发挥作用。     

柽柳类锌指基因ThZFL酵母诱饵表达载体的构建及其表达验证

利用PCR技术从柽柳cDNA文库中克隆出ThZFL目的基因序列,连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态,经检验后提取质粒,用BamH I和EcoR I限制性内切酶双酶切pMD18-T-ThZFL载体和pG-BKT7-BD空载体,并将酶切产物胶回收后,用T4 DNA连接酶连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态...     

梅花HD-Zip Ⅲ转录因子Pm HB5克隆与表达模式分析

梅花（Prunus mume）是我国特有早春木本观赏植物,因其花香清新、花型多样、树姿隽秀深受人们喜爱。梅花品种以直枝类为主,垂枝类和龙游类品种极少,因此株型是梅花育种的一个重要方向。植物HD-Zip Ⅲ转录因子作为调控分生组织形成和维持的重要转录因子,对枝条发育和株型建成具有重要调控作用。为揭示梅花株型性状形成的分子机理,本研究克隆了梅花PmHB5基因和启动子序列并进行了基因时空表达模式、启动子功能、激素应答和亚细胞定位分析。测序结果表明梅花PmHB5基因编码区长2 523 bp,编码840 aa,存在miR165/166的靶位点;PmHB5启动子存在大量的光响应元件、植物激素响应元件以及芽和分生组织特异性表达元件。qRT-PCR结果表明PmHB5基因在茎和叶芽中表达量较高,尤其是形成层和分化木质部组织中最高,且受赤霉素（GA3）、生长素（IAA）、玉米素（ZA）、激动素（KT）和油菜素内酯（BR）等诱导表达。梅花miR165和miR166在木质部、形成层和韧皮部中的表达量和PmHB5基因呈相反趋势。PmHB5启动子驱动GUS活性显示主要在转基因拟南芥花序分生组织、侧芽分生组织、茎和幼嫩叶片的维管组织等细胞分裂与分化活跃的部位表达较高。亚细胞定位表明PmHB5是在细胞核上形式功能的转录因子。本研究明确了梅花PmHB5基因的时空表达及激素应答模式,为深入研究PmHB5参与茎发育的分子机理提供了参考。