戊型肝炎病毒ORF3蛋白的原核表达和纯化

戊型肝炎病毒(HEV)是一种无包膜、单股正链RNA病毒,其基因组长约7.2kb,包含3个开放阅读框(ORF)。ORF3位于ORF1和ORF2之间,编码含有123个氨基酸的磷酸化蛋白。本文通过PCR扩增HEV ORF3基因,将扩增产物双酶切后,插入具有相同多克隆位点的pET28a(+)、pGEX-4T-1和pET-43.1a(+)载体中,构建pET28a-ORF3、pGEX-4T-1-ORF3和pET43a-ORF3原核表达载体。将重组质粒转入E.coli DH5α,菌液PCR筛选阳性结果。序列测定正确后,将其转化E.coli BL21(DE3),加入IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析目的蛋白表达后,进一步利用亲和层析法纯化目的蛋白。结果表明,成功构建了原核表达载体pET28a-ORF3、pGEX-4T-1-ORF3和pET43a-ORF3,所构建的载体均可在宿主菌E.coli BL21(DE3)中表达ORF3蛋白。通过Ni-TNA和GSH-Sepharose层析纯化分别分析3种融合蛋白,发现pET43a-ORF3最适合获得纯化蛋白的ORF3蛋白,这为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

东方粘虫中肠V-ATP酶a亚基的克隆及原核表达

对东方粘虫[Mythimna separata(Walker)]中肠V-ATPase a亚基(MS-VATPa)cDNA全长序列进行克隆、原核表达及纯化研究。采用RT-PCR和RACE技术克隆MS-VATPa基因,再亚克隆于原核表达载体pET-22b(+)以构建重组载体pET22b-MS-VATPa,将鉴定正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化目标蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot验证。结果表明:成功克隆东方粘虫中肠MS-VATPa基因的cDNA全长序列,并实现MS-VATPa基因在大肠杆菌原核表达系统中的可溶性表达。     

三黄鸡STING胞外区基因克隆及原核表达

[目的]克隆鸡干扰素基因刺激蛋白(STING)胞外区基因并进行原核表达,为了解STING蛋白的生物学功能及探讨禽类的固有免疫机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增鸡STING胞外区基因,与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组表达质粒,再转化BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行12% SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析.[结果]三黄鸡STING胞外区基因全长951 bp,与原核表达载体pGEX-4T-1可成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-STING,转化BL21 (DE3)感受态细胞后经1.0 mmol/L IPTG诱导表达4h,12% SDS-PAGE电泳检测得到一个带GST标签约62 ku的融合蛋白,采用抗GST多克隆抗体进行Western blotting鉴定,约在62 ku处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明目的蛋白原核表达正确,且特异性较高.[结论]从三黄鸡外周血淋巴细胞中克隆获得的STING胞外区基因片段可在原核细胞中高效表达,且纯化后的融合蛋白可用于制备鸡STING多克隆抗体.     

鳗鲡疱疹病毒ORF51基因的原核表达及多克隆抗体的制备

将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.     

核蛋白Sam68的原核表达及鉴定

为了构建pGEX-4T-1-Sam68原核表达载体,表达并鉴定GST-Sam68融合蛋白,采用PCR扩增Sam68基因,插入pGEX-4T-1的Eco R I和Sal I位点,并转化Rosetta(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot验证蛋白表达,GST pull-down技术验证Sam68的结合活性。酶切和测序结果证实Sam68基因正确插入pGEX-4T-1载体中,载体能够在Rosetta(DE3)细胞中正确表达,且纯化的GST-Sam68蛋白具有与PI3K p85特异结合的活性,说明成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-Sam68。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及其表达

以EGFP为标记基因,原核表达质粒pGEX-4T-1为载体,成功构建重组质粒pGEX-4T-EGFP,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG进行诱导表达,通过紫外照射和SDS-PAGE检测其在大肠杆菌中的表达情况,为原核表达系统提供新的报告基因和筛选标记。     

非核糖体肽合成酶腺苷化结构域在E.coli中的表达及底物特异性分析

侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)S62-9产生的抗菌肽(Brevibacillin,BBL)是一种非核糖体多肽,由非核糖体肽合成酶催化合成。本研究所用基因是从侧孢短芽孢杆菌(B. laterosporus)S62-9质粒基因组中克隆的一个非核糖体肽合成酶的腺苷化结构域(Nonribosomal peptide synthetase adenylation, NRPS-A)基因,根据此NRPS-A基因构建了pET21b-N1、pET21b-B2、pET22b-N1、pET22b-N3四个重组表达载体。将以上重组表达载体分别转化E. coli BL21、E. coli Rosetta(DE3)和E. coli Origami B(DE3)受体细胞,并用1 mmol/L异丙基β-d-硫代吡喃半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在16°C 200 r/min下进行诱导,将诱导产物用SDS-PAGE检测分析。结果显示,4种重组载体在E.coliBL21中均无表达,在E.coliRosetta(DE3)大量表达但均以包涵体形式存在,在E. coli Origami B(DE3)均表达,但只有pET22b-N3这一重组表达载体出现了可溶性融合蛋白。可溶性融合蛋白对赖氨酸有较高的腺苷化活性,表明该A结构域负责抗菌肽BBL中的赖氨酸的识别和上载。该研究结果不仅为其它NRPS-A域的可溶性表达提供了方法,同时为研究抗菌肽BBL的生物合成机制提供依据。     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

二色补血草LbGST基因的原核表达载体构建与表达

从二色补血草(Limonium bicolor)中分离出一个编码谷胱甘肽硫转移酶(LbGST)基因,并将该基因构建到pGEX-4T-2原核表达载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,利用0.1 mmol/L的IPTG诱导该基因在大肠杆菌BL21中进行表达.SDS-PAGE检测表明,出现了特异的...     

大麦黄矮病毒运动蛋白基因克隆及原核表达

[目的]构建大麦黄矮病毒运动蛋白（BYDV-MP）基因的原核表达载体,并在E.coli-BL21中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的大麦黄矮病毒PAV6株系的基因序列设计合成1对引物,应用RT-PCR技术从感染大麦黄矮病毒的叶片中扩增得到大麦黄矮病毒（BYDV）的运动蛋白（MP）基因,利用基因重组技术构建pGEX-4T-1-MP,将其转化至大肠杆菌表达菌株E.coli-BL21（DE3）中,用IPTG诱导重组质粒pGEX-4T-1-MP在E.coli-BL21中进行表达。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定,鉴定正确后,与GeneBank中收录的大麦黄矮病毒PAV6株系的MP基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下,高效表达出相对分子质量约43 kD的蛋白,蛋白质电泳（SDS-PAGE）结果表明,表达的蛋白条带与预期的GST-MP融合蛋白相符。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-MP的原核表达载体,在E.coli-BL21中高效表达了MP,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

大肠杆菌异质型ACCase亚基基因accB重组表达载体的构建和原核表达

摘要：克隆大肠杆菌乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl CoA Carboxylase, ACCase）的生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein,BCCP）亚基基因accB,构建accB的原核表达载体pGEX-4T-accB,转化大肠杆菌BL21（DE3）工程菌株, IPTG诱导进行融合表达,成功诱导表达了GST-accB融合蛋白,大小为43KDa。     

pGEX-4T-1-cMC4R原核表达载体的构建与表达

[目的]构建犬MC4R基因编码区的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。[方法]以Beagle犬基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的片段,利用LP Recco PCR克隆技术将目的片段直接重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,BamHI、XhoI酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R转化到E.co-liBL21内,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE检测犬MC4R蛋白的表达。[结果]成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R,经DNA测序证实插入序列与设计基本一致,只有777位碱基T变成了C,这是由于犬MC4R编码区存在的多态性引起,对表达的犬MC4R蛋白序列无影响。大肠杆菌诱导后表达出犬MC4R融合性蛋白。[结论]成功构建犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供帮助。     

小麦热激蛋白60(HSP60)基因的克隆与原核表达(摘要)(英文)

[目的]构建小麦热激蛋白60(HSP60)基因的原核表达载体,并在E.coli中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的小麦HSP60基因序列设计合成1对引物P1/P2,利用RT-PCR方法从小麦RNA中扩增小麦HSP60基因,应用基因重组技术构建pGEX-4T-1-HSP60表达载体,将构建好的小麦HSP60基因原核表达载体pGEX-4T-1-HSP60转化至大肠杆菌表达菌株E.coliBL21感受态细胞。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定鉴定正确后,与GenBank中收录的小麦HSP60基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下获得了目的蛋白,所表达的GST-HSP60融合蛋白分子量约为90kD。蛋白质电泳(SDS-PAGE)结果表明,表达的蛋白条带与预期大小一致。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-HSP60的原核表达载体,在E.coliBL21中高效表达了HSP60蛋白,为进一步研究该蛋白的功能及其作用机制奠定了基础。     

大肠杆菌γ-ggt原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt的构建及其蛋白表达

构建大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt及表达与鉴定目的蛋白,为进一步利用该酶催化合成茶氨酸等目的产物奠定了基础。以大肠杆菌DH5α总DNA为模板,用PCR法在γ-ggt编码序列上下游引入酶切位点并扩增出γ-谷氨酰转肽酶基因;将γ-ggt编码序列克隆入原核表达载体pGEX-4T-1的相应酶切位点;用PCR鉴定重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt,并对插入基因片断测序;重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导后用SDS-PAGE分析表达产物,并经Westernblot鉴定。获得大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶基因,并成功构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化有pGEX-4T-1/γ-ggt工程菌BL21(DE3)经1 g/L乳糖诱导1 h后即开始表达目的蛋白,在诱导6 h后表达蛋白量达到最高,随着时间的延长,目的蛋白没有被降解,此蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot鉴定了此目的蛋白。成功构建了大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt,并进行了目的蛋白的鉴定。     

猪瘟兔化弱毒株E~(rns)基因在大肠埃希氏菌中的表达、纯化

将猪瘟兔化弱毒株Erns基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经PCR和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western-Blot检测,结果表明,融合表达蛋白的分子量约为55kD,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45%。表达蛋白与兔抗CSFV多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。利用GST亲和层析柱对Erns融合蛋白进行了纯化。     

谷胱甘肽-S-转移酶-ASPP2融合蛋白的原核表达及纯化

为表达并初步纯化包含ASPP2活性区域和不包含其活性区域的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-ASPP2融合蛋白。采用PCR扩增两段ASPP2基因短片段,在引物5'端和3'端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,将其克隆进入原核表达载体pGEX-4T-1;异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒pGEX-4T-1-ASPP2在大肠杆菌BL21(DE3)中表达同时带有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签的融合蛋白;超声法裂解大肠杆菌,应用谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化可溶的GST-ASPP2融合蛋白;通过SDS-PAGE和Western blot验证GST-ASPP2融合蛋白的表达。结果表明,已成功的构建了GST-ASPP2小片段融合蛋白表达载体,在Western blot分析中,4个蛋白条带均能被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别,条带所在位置和GST-ASPP2的分子质量相符。构建了GST-ASPP2重组质粒,在大肠杆菌BL21中高效表达GST-ASPP2融合蛋白,为进一步研究ASPP2全长,N-末端和C-末端生理意义奠定了基础。     

新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF39L基因克隆、表达及抗体的制备

为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构建原核表达质粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2;将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2;用所得融合蛋白分别免疫小鼠,获得了高效特异抗体39Ab1和39Ab2;利用制备的抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示,VP39参与了SGIV的装配。本研究结果为进一步研究ORF39L基因在SGIV感染过程中的作用机制提供了数据资料。     

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆及原核表达

根据GenBank上已有的副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列,设计并人工合成引物.将耐热直接溶血毒素的基因全长克隆到大肠杆菌表达载体pGEX- 4T-1上,构建重组表达载体tdhA/pGEX- 4T-1和tdhS/pGEX- 4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达的工程菌株.优化诱导表达条件,表达耐热直接溶血毒素.转化有重组质粒tdhA/pGEX- 4T-1,tdhS/pGEX- 4T-1的BL21可稳定高效地表达可溶形式的目的蛋白.表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,用GST琼脂糖珠柱亲和层析纯化.溶血实验表明,表达的蛋白具有溶血活性.     

人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的初步表达

目的:构建人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)原核表达载体,检测其在大肠杆菌Escherichia coli中的初步表达.方法:以含有人tPA基因的质粒为模板,设计引物扩增出含有RGDS-tPA基因并构建到原核表达载体pET28a中,测序证实为正确的rtPA序列,并将pET28a-tPA转化至菌株E.coli BL21(DE3).用IPTG诱导rtPA在E.coli中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证.结果:琼脂糖凝胶电泳获得目的基因片段tPA的条带约在1 700bp处,鉴定为阳性重组体;聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得目的蛋白片段rtPA的条带约53KDa,为非活性的包涵体.结论:人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体构建成功,可在大肠杆菌中有效表达.