大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达

对大肠杆菌的外膜蛋白A基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达,为大肠杆菌重组疫苗的构建奠定基础.以大肠杆菌分离株308-2菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因ompA进行扩增,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pET32a(+)连接构建表达ompA的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主E coli Ros...     

凋亡素原核表达及纯化

为进一步研究凋亡素结构与功能和制备凋亡素单克隆抗体,本试验构建了凋亡素的原核表达载体pET-28a-VP3,并将该质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白.结果证明在E.coli BL21中正确表达了凋亡素,同时对表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示在1.4 kD处出现目的蛋白带与预期相符.     

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。     

烟夜蛾(Helicoverpa assulta Guenée)滞育激素基因在大肠杆菌中的表达

采用RT PCR技术从烟夜蛾(HelicoverpaassultaGuen啨e)滞育蛹中扩增到滞育激素(diapausehormone,DH)基因cDNA,将其与pET 30a(+)质粒连接后转化至大肠杆菌BL21中,测序结果表明,重组质粒插入片段编码序列完整,读框正确;重组工程菌用IPTG诱导表达后,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到一条约21kDa大小的外源蛋白,它与DH的大小相应.DH基因原核表达载体的成功构建为大量获取DH重组蛋白、研究DH的结构及功能奠定了基础.     

猪BMP4基因原核表达及优化

构建猪BMP4基因pET32a-BMP4原核表达质粒,在E.coli中表达并分离纯化目的蛋白。采用PCR技术以pMD18-T-BMP4重组质粒为模板扩增获得BMP4基因编码成熟肽片段,并插入到原核表达载体pET32a中,构建原核表达重组质粒pET32a-BMP4。将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,在不同的温度、IPTG浓度和时间下进行诱导表达,SDS-PAGE分析鉴定。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,表达宿主菌经IPTG诱导表达分子量约为31 ku的融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的30%以上。成功构建了pET32a-BMP4原核表达质粒,并经纯化得到BMP4目的蛋白,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

人源弹性蛋白酶基因原核载体构建及表达

从人体肾脏组织中提取的总RNA中通过反转录PCR(RT-PCR)扩增得到了ELA2B基因,并将其克隆到pGEM-T easy载体中.然后用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对重组质粒pGEM-T easy/ELA2B和大肠杆菌E.coli表达质粒pET30a进行双酶切,成功构建了原核表达载体pET30a/ELA2B.将重组质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21中,通过PCR和表型鉴定表明,ELA2B基因已经整合到大肠杆菌BL21染色体上.用IPTG对重组的大肠杆菌BL21进行诱导表达,得到的蛋白经SDS-PAGE分析结果表明:菌体中含有一明显特异性蛋白,大小为28 kD.经包涵体复性后在弹性蛋白酶活性检测平板上发现有代表弹性蛋白酶作用的透明圈产生,可初步证实表达产物具有生物活性.     

鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。     

东方粘虫中肠V-ATP酶a亚基的克隆及原核表达

对东方粘虫[Mythimna separata(Walker)]中肠V-ATPase a亚基(MS-VATPa)cDNA全长序列进行克隆、原核表达及纯化研究。采用RT-PCR和RACE技术克隆MS-VATPa基因,再亚克隆于原核表达载体pET-22b(+)以构建重组载体pET22b-MS-VATPa,将鉴定正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化目标蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot验证。结果表明:成功克隆东方粘虫中肠MS-VATPa基因的cDNA全长序列,并实现MS-VATPa基因在大肠杆菌原核表达系统中的可溶性表达。     

磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达

[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

中华大蟾蜍g a l e c t i n - 3c D N A的克隆、序列分析及原核表达载体的构建

通过PCR扩增出中华大蟾蜍Bufo gargarizans半乳糖凝聚素3(gal-3)cDNA全长开放读码框(ORF)并克隆至pGM-T载体,经DNA测序确定获得全长ORF序列(GenBank登录号为JN993733).序列分析表明中华大蟾蜍gal-3的ORF是由789个碱基组成,编码262个氨基酸残基组成的蛋白质.推导氨基酸序列同源性比较发现,中华大蟾蜍与非洲爪蟾Xenopus lavis同源性最高,为51%,与其他10种动物的同源性在41%～50%之间.SMART分析显示gal-3蛋白在136-259位氨基酸存在保守的半乳糖结合域.Net Phos预测gal-3在Ser-6和Ser-186有潜在的丝氨酸磷酸化位点.gal-3氨基酸序列构建的进化树符合传统动物分类学特点.经菌落PCR、双酶切和DNA测序确认gal-3的ORF正确插入原核表达载体pET-28b,表明原核表达用重组质粒构建成功,为研究其蛋白功能和生物学功能奠定了基础.     

p E G F P - N 3 - L P L重组真核表达载体的构建及在V e r o细胞中的表达

目的:构建贵州白香猪LPL基因与增强型绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pEGFP-N3-LPL,转染Vero细胞,观察重组质粒的表达.方法:采用HindⅢ和BamHⅠ两种限制性内切酶获得LPL基因编码区片段和pEGFP-N3线型载体,将目的片段与该载体连接、转化、挑取阳性克隆,进行菌落PCR、双酶切及测序鉴定.使用Lipofectamine2000将重组质粒转染Vero细胞,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达并对其进行mRNA检测.结果:成功构建重组真核表达载体pEGFP-N3-LPL,经mRNA检测,实验组在1 500bp处出现特异性条带,说明重组载体已在Vero细胞中获得表达.结论:本试验构建的真核细胞表达载体pEGFP-N3-LPL,为进一步阐明LPL基因与肌内脂肪沉积间的生物学作用机制奠定了基础.     

K R T 8对H B V复制影响的体外研究

目的:研究宿主蛋白KRT8对HBV复制的影响.方法:体外培养稳定表达HBV的肝癌细胞株(HepG2.2.15),分别用干扰KRT8基因的siRNA转染HepG2.2.15细胞和高表达KRT8基因的质粒转染HepG2.2.15细胞.RT-PCR验证转染效率,荧光定量PCR检测转染48小时后的细胞上清液HBV DNA水平.用拉米夫定抑制HepG2.2.15细胞HBV复制,RT-PCR检测基因表达水平.对数据采用t检验和方差分析,p<0.05为差异有统计学意义.结果:干扰KRT8基因表达后,HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA水平与对照组相比下降34%～38%(p<0.05).高表达KRT8基因后,HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA水平是对照组的28倍(p<0.01).抑制细胞HBV DNA复制后,HepG2.2.15细胞KRT8mRNA水平与对照组相比,下降了24%,但统计学无明显差异.结论:抑制宿主KRT8基因表达具有抗病毒作用.     

水分胁迫和接种丛枝菌根对香樟幼苗根系形态特征的影响

为了探索喀斯特地区植物接种丛枝菌根真菌后幼苗的耐旱适应性,我们对香樟Cinnamomum camphora进行了幼套球囊霉Glomus etunicatum、层状球囊霉Glomus lamellosum和摩西球囊霉Glomus mosseae的单独接种和混合接种处理.香樟苗接种80d后再进行60d的强度(维持田间持水量的35%～45%)、中度(维持田间持水量的50%～60%)、轻度(维持田间持水量的65%～75%)和正常浇水(维持田间持水量的80%～90%)的水分胁迫处理.用WinRhizo分析系统测定苗木根系形态指标.结果表明:水分和菌根真菌的交互作用使香樟幼苗根系形态发生改变,以适应土壤环境.中度水分胁迫能提高根系总长和根尖数量,但是水分胁迫降低了根系生物量的积累和根体积.根系生物量、根系总长,根系表面积、根体积和根尖数表现为接种处理高于非接种处理.非接种处理的根平均直径在重度和中度水分胁迫下显著增强.菌根真菌接种处理的根系,平均直径随水分胁迫增加而有所降低.相同胁迫下的不同菌种处理之间,幼套球囊霉和混合接种处理较摩西球囊霉和层状球囊霉有较高的菌根依赖性.而在同一接种处理条件下,中度水分胁迫的香樟幼苗具有较强的菌根依赖性,重度水分胁迫却降低了菌根依赖性.同一水分条件下混合接种和幼套球囊霉有较高的菌根依赖性.     

4种魔芋资源的裂片及其表皮细胞的形态学比较研究

以白魔芋等4种魔芋资源为材料,对其裂片及表皮细胞进行形态学比较研究,结果表明:白魔芋裂片披针形,尖端长尾状,钝齿状叶缘,表皮细胞含丰富内含物;花魔芋裂片卵圆形,尖端渐尖,基部左侧偏大,叶缘浅波状,气孔器呈平行型排列;珠芽魔芋裂片椭圆形,皱波状叶缘,基部盾圆,表皮细胞为4种资源最大;甜魔芋裂片卵状三角形,尖端盾尖,气孔器呈不等型排布.     

大孔树脂纯化翅果油树叶片多糖的研究

该文研究了5种树脂对翅果油树叶片多糖的静态吸附及解析性能,选取出一种吸附和解析效果均较好的树脂进行了动态试验研究.结果表明:AB-8树脂对翅果油树叶片多糖的吸附和解析效果较好;AB-8树脂在吸附时间为100min,吸附液为30℃,pH值为7,最佳上样量与树脂比例为6∶1,吸附流速为1mL/min时吸附效果较好.用40mL的蒸馏水洗脱效果最好,洗脱率可达82.095%.对AB-8树脂的再生性能进行研究表明,树脂重复使用4次,其吸附能力仍较为稳定.     

农杆菌介导转化油菜中几种影响玻璃化频率的因素

在用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜的组织培养过程中,常会伴生着试管苗玻璃化现象的发生,此现象的发生会降低转基因的频率.本试验结果表明,影响玻璃化发生的因素较多,包括激素体积质量分数、蔗糖体积质量分数、琼脂体积质量分数和接种密度等.其中,激素6-BA和ZT体积质量分数对诱芽率和玻璃化率都有显著影响,随着体积质量分数的升高,玻璃化率升高,以6-BA体积质量分数为1mg/L,ZT体积质量分数为2mg/L时结果较为理想.蔗糖体积质量分数和琼脂体积质量分数对玻璃化率也有显著影响,当二者体积质量分数升高,玻璃化率降低,同时诱芽率也降低.综合分析,当蔗糖体积质量分数为50g/L,琼脂体积质量分数为10g/L时最适宜.接种密度对玻璃化的发生有显著影响,密度越高,玻璃化倾向越严重,而密度对诱芽率影响不明显.试验结果分析发现,接种密度为20～30个/皿最适宜.     

S i m o n效应源于反应选择阶段:基于知觉负荷对S i m o n效应的影响

将Simon任务与知觉负荷任务的视觉搜索范式相结合,通过比较高低负荷条件下Simon效应的大小,探讨Simon效应的产生是否与刺激鉴别阶段有关.实验一的刺激为颜色,实验二的刺激为字母.两个实验的结果均显示,高负荷条件和低负荷条件下的Simon效应差异并不显著,表明Simon效应的产生与刺激鉴别阶段的加工无关,同时也说明无关刺激位置的编码是自动激活的.     

S u p e r c y c l i c算子族的公共超循环向量

讨论一族不可数的Supercyclic算子{Ft}t∈Λ的公共Supercyclic向量,并给出算子族{Ft}t∈Λ的公共Supercyclic向量在无限维、可分的Banach空间X中是稠密集的两个新的充分条件.     

一类完全图与简单图的多重联图的邻点可区别E 全染色

针对星、路、圈与完全图之间的关系,讨论了星、路、圈和完全图的多重联图的邻点可区别E-全染色,并给出了它们的邻点可区别E-全色数.