原花青素对脂多糖诱导的环氧合酶-2表达的抑制作用

以脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞为模型,研究原花青素对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞中环氧合酶-2(COX-2)mRNA转录的抑制机制。采用RT-PCR法测定原花青素对LPS诱导的RAW264.7细胞中COX-2mRNA转录的影响,采用Western blot和免疫组化法考察原花青素对LPS诱导的RAW264.7细胞核转录因子κB(NF-κB)亚基p65(NF-κB/p65)及NF-κB结合蛋白(I-κB)表达的影响。结果发现LPS处理RAW264.7细胞可以明显上调COX-2 mRNA的表达,同时降低胞质蛋白I-κB的表达水平,增加NF-κB的水平。原花青素对RAW264.7细胞中COX-2 mRNA的转录有较强抑制作用,抑制NF-κB/p65的表达及I-κB的降解,原花青素可能是通过抑制NF-κB/p65的表达及I-κB/p65的降解而抑制COX-2的表达。     

梅花鹿鹿茸细胞端粒酶活性及其mRNA表达的检测

[目的]研究鹿茸生长期端粒酶的表达,为揭示鹿茸生长发育的调控机制提供了新思路。[方法]在鹿茸快速生长阶段,采用改进的TRAP（端粒重复序列扩增技术）法检测鹿茸顶端增殖区的间充质层、前软骨层和软骨层细胞及下端成熟区的端粒酶活性。同时,采用RT-PCR的方法检测各组织细胞中端粒酶催化亚基（TERT）mRNA的表达水平。[结果]在顶端增生区各组织细胞中均检测到了不同程度的端粒酶活性,间质细胞、前软骨细胞和软骨细胞中的相对端粒酶活力分别为91.2、46.4和13.7,而在成熟区组织中则检测不到端粒酶活性。RT-PCR法检测的各组织细胞中TERTmRNA的表达水平与端粒酶活性检测结果一致。[结论]在鹿茸快速生长阶段,其增殖区表达端粒酶,并且端粒酶活性随组织层细胞的分化程度的增高而逐渐降低,说明端粒酶可能在鹿茸的生长过程中起重要的调控作用。     

心痛舒含药血清预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤及TNF-α、IL-1β的影响

目的观察心痛舒含药血清预处理对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞核因子-κBp65(NF-κBp65)及其下游调控因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)的影响,探讨心痛舒对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用机制。方法原代培养SD乳鼠心肌细胞,建立模拟心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,设正常组、模型组、阳性对照组、心痛舒含药血清预处理组共4组。罗丹明B染色法观察心肌细胞形态,ELISA法测定培养液上清TNF-α、IL-1β含量,半定量RT-PCR方法检测NF-κBp65 mRNA表达水平。结果与模型组比较,阳性对照组、心痛舒含药血清预处理组TNF-α、IL-1β水平降低,NF-κBp65 mRNA的表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.01);与阳性对照组比较心痛舒含药血清预处理组NF-κBp65 mRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论心痛舒含药血清预处理可通过抑制缺氧-复氧心肌细胞炎症反应途径发挥保护作用,其机制与抑制NF-κB活化,从而抑制下游炎性细胞合成有关。 更多还原     

牛体细胞中端粒酶组分的表达及端粒酶活性的研究

端粒酶是一种能够以自身的RNA组分为模板在染色体末端添加端粒重复序列的核酸蛋白复合体酶，主要由端粒酶RNA组分（TERC）与端粒酶逆转录酶组分（TERT）构成。通过对成年牛组织中端粒酶的这两种组分的表达情况及端粒酶活性状态进行检测，探讨牛端粒酶组分的组织特异性表达以及与端粒酶活性之间的关系。应用RT-PCR检测了成年牛的心脏、肾脏、肝脏及睾丸中TERC和TERT基因的mRNA表达情况，利用TRAP银染法检测各组织中的端粒酶活性状态。结果表明砸RC基因在这4种组织中均有表达，但转录水平在各组织之间有差异；TERT基因仅在睾丸中表达，在其他3种组织中均没有表达，端粒酶活性同样只在睾丸中检测到。由此可见牛端粒酶活性在体细胞中普遍受到抑制，仅在生殖腺中具有活性。端粒酶两种组分的转录是相互独立的，逆转录酶TERT组分是端粒酶活性的关键成分。     

NF-κB信号通路在丝状支原体山羊亚种感染中的作用

为分析细胞核转录因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路在丝状支原体山羊亚种(Mmc)感染山羊肺泡上皮细胞中的分子作用机制,将Mmc感染细胞,于4 h、8 h、12 h和24 h收集细胞,利用实时定量PCR检测NF-κBp65 mRNA的表达水平。采用不同浓度的NF-κB抑制剂BAY11-7082与细胞孵育1 h,然后用Mmc感染细胞,于24 h收集细胞,利用实时定量PCR检测白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的表达水平,用试剂盒检测Caspase-3活性、H2O2和NO浓度变化,利用平板计数检测Mmc对细胞的致病力变化。结果显示,Mmc于8 h、12 h和24 h等3个时间点显著提高细胞NF-κBp65 mRNA表达水平(P0.01);Mmc显著提高细胞IL-8 mRNA水平、TNF-αmRNA水平、Caspase-3的活性、H2O2和NO浓度(P0.01),而BAY11-7082(浓度为5μmol/L和10μmol/L)能够显著降低Mmc介导的细胞IL-8 mRNA水平、TNF-αmRNA水平、Caspase-3的活性、H2O2和NO浓度的升高(P0.05),且可显著降低细胞中Mmc存活量(P0.05)。综上可知,NF-κB信号通路在Mmc致病机制中发挥重要作用。     

端粒酶催化亚基活性中心hTERT的克隆及其真核表达

本实验采用RT—PCR技术,应用高保真DNA聚合酶从人喉癌细胞中扩增端粒酶催化亚基活性中心基因片段,将克隆载体上hTERTcDNA用EcoR I和HindⅢ双酶切,连入真核表达载体pCR3．1,利用pCR3．1载体上带有强的CMV启动子,高效表达活性中心蛋白,采用RT—PCR检测hTERT mRNA的表达情况,结果表明,在细胞内检测到了mRNA,证明该cDNA在细胞内确实得到了表达,并采用TRAF-ELISA方法检测端粒酶活性。     

β-胡萝卜素的不同添加方式对脂多糖刺激的RAW264.7细胞炎症的影响

为探讨β-胡萝卜素不同添加方式(预防型和治疗型)对脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞的细胞活力、活性氧(ROS)、炎性因子以及NF-κB通路的影响,利用MTT法检测细胞活力确定β-胡萝卜素的最佳添加浓度和时间,流式细胞仪检测ROS的百分含量,荧光定量PCR检测炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA相对表达量;Western Blot测NF-κB p65蛋白的表达量分析β-胡萝卜素对NF-κB通路的影响。结果表明:对于LPS刺激的RAW264.7细胞,治疗型和预防型添加β-胡萝卜素均可以提高细胞活力,且在治疗型添加模型中,可极显著提高(P0.01);治疗型和预防型添加β-胡萝卜素均可以降低ROS百分含量、炎性因子mRNA相对表达量和NF-κB p65蛋白表达量。综上所述,不同添加方式的β-胡萝卜素对LPS刺激的巨噬细胞的细胞活力均有提升作用,对ROS和炎性因子均有抑制作用,且这种抑制作用可能与NF-κB通路有关。     

端粒酶RNA亚基的shRNA对细胞端粒酶活性影响的研究

[目的]探讨端粒酶RNA亚基（chTR）的短发RNA（shRNA）shRNA对MDCC-MSB1细胞端粒酶活性的影响。[方法]设计合成chTRshRNA并构建表达载体,转染MDCC-MSB1细胞,应用改良TRAP法检测端粒酶活性。[结果]与对照组相比,转染24 h后,各组端粒酶活性变化不明显;转染48 h后,端粒酶活性均显著地下降,且针对模板区设计的干扰载体pSi-chTR-sh1转染后抑制效果最明显。[结论]chTRshRNA表达载体能够有效地抑制MDCC-MSB1细胞的端粒酶活性。     

辛伐他汀对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺组织中NF-κB表达及血清C反应蛋白和TNF-α水平的影响

目的观察辛伐他汀对野百合碱（MCT）诱导的肺动脉高压大鼠核因子NF-κB的表达及血清C反应蛋白和TNF-α水平的影响,探讨辛伐他汀治疗肺动脉高压的作用机制。方法将30只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组,MCT诱导的肺动脉高压组（模型对照组）,辛伐他汀干预治疗组（治疗组）。注射野百合碱建立动物模型,右心导管法检测大鼠平均肺动脉压（mPAP）,测量右心室肥大指数（RVHI）。采用Western blot法检测各组大鼠IKKα,IκBα和NF-κB p65蛋白表达情况。结果治疗组大鼠的mPAP和RVHI均显著低于模型对照组;治疗组大鼠肺组织NF-κB p65蛋白表达及血清C反应蛋白和TNF-α水平均明显低于模型对照组,差异均有统计学意义（P＜0.01或0.05）。结论辛伐他汀可有效降低MCT诱导肺动脉高压模型大鼠的肺动脉压、改善肺血管重构,其机理可能与抑制肺组织核因子NF-κB的表达及炎症因子的释放有关。     

苦参碱对金黄色葡萄球菌入侵BMECs的干预作用

【目的】研究苦参碱在金黄色葡萄球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)过程中的干预作用及其原因,为苦参碱的临床应用奠定基础。【方法】用CCK-8法检测苦参碱对BMECs增殖的影响,用庆大霉素保护试验检测苦参碱对金黄色葡萄球菌入侵BMECs的影响;并在苦参碱干预金黄色葡萄球菌感染BMECs后,分别采用RT-qPCR检测BMECs中抗菌肽基因的表达,Greiss法检测NO的分泌,Western blot检测NF-κB通路蛋白p65的表达。【结果】25～100μg/mL苦参碱均能促进BMECs的增殖,并能抑制金黄色葡萄球菌入侵BMECs;苦参碱干预能显著下调BMECs中抗菌肽基因TAP和BNBD5 mRNA的表达,抑制NO的分泌和NF-κB的活化,并呈剂量依赖性。【结论】苦参碱通过抑制NF-κB的活化来抑制金黄色葡萄球菌入侵BMECs,并可显著下调金黄色葡萄球菌感染的BMECs中抗菌肽基因的表达。     

千里光石油醚提取物对LPS激活的炎症反应的抑制效应

以千里光石油醚提取物（PEESS）为材料，以脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7小鼠单核巨噬细胞为炎症模型，通过CCK-8法检测细胞增殖、Griess法检测一氧化氮（NO）含量、RT-PCR法检测炎症相关因子的表达，及Western blot法检测炎症关键转录激活因子的活化，研究PEESS的抗炎作用及可能的分子机制。结果显示，0~80 μg/mL的PEESS对巨噬细胞增殖无明显影响，但能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的分泌，并呈浓度依赖性；炎症相关因子基因mRNA表达检测结果显示：PEESS能显著抑制LPS刺激的RAW264.7 细胞炎症模型中IL-1β及IL-6的表达；同时，PEESS还显著降低了NF-κB p65及 p44/p22 MAPK蛋白的磷酸化水平。以上结果表明，千里光石油醚提取物对LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症模型具有较好的抗炎效应，其作用发挥可能与其抑制NF-κB和MAPK信号通路的活化以及NO、IL-1β和IL-6等炎症介质的分泌有关。     

脱氧核酶对端粒酶hTERT mRNA的切割以及对鼻咽癌细胞凋亡相关基因的影响

目的:探讨脱氧核酶对端粒酶蛋白亚基hTERTmRNA的切割作用及对人鼻咽癌细胞凋亡相关基因表达的影响。方法:针对hTERT基因的核苷酸序列,合成“10～23”型脱氧核酶及其类似物,提取总RNA在体外切割hTERTmRNA;转染鼻咽癌细胞后,用RT-PCR扩增hTERT基因片段,用PCR-ELISA法测定端粒酶活性,用RT-PCR和荧光免疫测定凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果:未经修饰的脱氧核酶DzT和在DzT的3'末段添加倒位连接T碱基的脱氧核酶DzTi在体外能够有效地切割hTERTmRNA;在转染鼻咽癌细胞后,DzTi比DzT对hTERTmRNA表现出更强的切割作用,DzTi能够显著地降低鼻咽癌细胞端粒酶活性(P<0.01)、抑制鼻咽癌细胞的生长(P<0.05)和bcl-2基因的表达(P<0.05),上调bax基因的表达(P<0.05)。DzT和DzTi的催化中心的一个碱基被替换后形成的脱氧寡核苷酸DzT'和DzTi'在体外和胞内均不表现对hTERTmRNA的切割作用。结论:人工合成的脱氧核酶确实能够高效特异地切割端粒酶hTERTmRNA,并降低鼻咽癌细胞的端粒酶活性,促进鼻咽癌细胞凋亡。作为一种新发现的催化性核酸,脱氧核酶在肿瘤的基因治疗领域中将具有极其重要的应用价值。     

小鼠NF-κB p65亚基真核表达质粒的构建

[目的]构建小鼠NF-κB p65亚基真核表达质粒。[方法]扩增NF-κB p65亚基,然后构建其真核表达质粒(m-NF-κB-p65-p EGFPC1),并通过PCR和测序验证重组质粒中p65亚基的正确性;然后提取无内毒素的质粒,转染Hep G2细胞,通过观测重组蛋白所融合的绿色荧光蛋白,检测目的蛋白表达情况。[结果]PCR产物的电泳结果显示,成功扩增了小鼠NF-κB p65亚基,成功构建了小鼠NF-κB p65亚基的真核表达质粒,将其命名为m-NF-κB-p65-p EGFP-C1。在真核细胞中,重组质粒可以成功表达小鼠NF-κB p65亚基融合绿色荧光蛋白的目的蛋白。[结论]重组质粒NF-κB-p65-p EGFP构建成功,为后续开展NF-κB信号通路的相关研究奠定了基础。     

11S通过NF-κB信号通路引起猪小肠上皮细胞损伤

通过体外培养猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),研究大豆球蛋白(11S)对猪小肠上皮细胞的影响。将IPEC-J2细胞分为6组[A(对照组)、B、C、D、E和F],各组中分别添加0、1、5、10、5、5 mg·mL~(-1)的11S,并且在E组和F组分别添加1μmol·L~(-1)吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)和1μmol·mL~(-1) Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)。分别于8、16、24 h,用CCK-8法检测细胞存活率,用ELISA法检测细胞一氧化氮(NO)、二胺氧化酶(DAO)、5-羟色胺(5-HT)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素10(IL-10)含量,用western blot法检测细胞p-NF-κB p65、iNOS、COX-2的蛋白表达量,用qPCR法检测细胞NF-κB p65、IKKβ、iNOS、IKKα、COX-2 mRNA的相对表达量。结果表明:11S可以降低猪小肠上皮细胞存活率,添加PDTC和L-NAME可以提高小肠上皮细胞存活率;11S可促进NO、DAO、5-HT和IL-6的分泌,降低IL-10的分泌,增加p-NF-κB p65、iNOS、COX-2的蛋白表达量及NF-κB p65、IKKβ、iNOS、IKKα、COX-2 mRNA的相对表达量,添加PDTC和L-NAME可抑制11S的作用。综上,11S可引起猪小肠上皮细胞损伤,随着11S浓度的增大,损伤程度增加,PDTC和L-NAME可以降低11S对细胞的损伤。     

人端粒酶催化亚基hTERT活性中心基因的克隆及其真核表达载体的构建

人端粒酶催化亚基是端粒酶活性所必须的组分，通过提取端粒酶活性癌组织的mRNA，反转录获得端粒酶活性中心基因的cDNA片段，PCR扩增获得端粒酶催化亚基活性中心基因，并将扩增产物连入真核表达载体pCR3.1，利用pCR3.1载体的自身特点即具有T7启动子，可在真核细胞内启动基因的转录与表达，为将来获得端粒酶酶活性中心蛋白，研究其结构与功能奠定了基础，从而为解决肿瘤问题提供新的思路。     

重楼水提物对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响

目的 探讨重楼水提物对人肝癌HepG2细胞株增殖和凋亡的影响.方法 以体外培养的肝癌HepG2细胞为研究对象,MTT法检测重楼对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪Annexin V/PI 双染法检测重楼对其凋亡的影响,ELISA法检测Bcl-2、Bax 蛋白表达的情况.结果 不同浓度重楼水提物能有效抑制HepG2细胞的增殖,且呈时间及浓度依赖性,作用效果在12 μg/ml时抑制效果最好（P〈0.01）.12 μg/ml重楼水提物作用HepG2细胞24 h、48 h后,结果表明HepG2随着重楼水提物作用时间的延长,细胞凋亡率增加,与阴性对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.01）.12 μg/ml重楼水提物作用HepG2 细胞24 h后,Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达增加,与阴性对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 重楼水提物能抑制HepG2细胞的体外增殖,抑制作用表现出时效关系,其机制可能与促进细胞凋亡、降低Bcl-2蛋白表达、增加Bax蛋白表达有关.     

新城疫病毒感染通过蛋白激酶激活NF-κB信号通路诱导干扰素和炎症因子的表达

[目的]本文旨在探究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染过程中细胞因子显著上调的机制。[方法]NDV感染He La细胞,用RT-PCR法检测IFN-β、IL-6、IL-8 mRNA水平。Western blot分析和免疫荧光分析检测NDV对双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)与NF-κB信号通路的影响。[结果]与未感染组相比,IFN-β、IL-6、IL-8 mRNA水平显著上调。NF-κB信号通路在感染后12~24 h被激活,转录因子p65入核,而使用NF-κB信号通路抑制剂IKK16则显著降低了干扰素和炎症因子的表达,证明NF-κB信号通路介导NDV感染过程中的细胞因子表达和炎症反应。另外,在病毒感染过程中,病原模式识别受体PKR被诱导表达并且被磷酸化激活。使用抑制剂2-氨基嘌呤抑制PKR活性后,能够抑制p65的入核,并减少由NDV诱导的干扰素和炎症因子表达。[结论]NDV感染能够通过PKR调控NF-κB信号通路,引起细胞因子显著上调。     

小槐花提取物对甲型H1N1流感病毒感染的体外抑制作用

采用CCK8法测定小槐花提取物在MDCK细胞上的最大安全浓度（Maximum no-cytotoxic concentration, MNTC）;建立甲型流感病毒A/PR8/34(H1N1, PR8)感染MDCK细胞模型,CCK8法检测其对病毒感染细胞病变的抑制作用;利用荧光定量PCR及免疫印迹方法,检测小槐花提取物对流感病毒基因、蛋白,以及宿主炎症相关转录因子和炎性细胞因子表达的影响。细胞毒性试验结果显示,小槐花提取物对MDCK细胞的MNTC为100 mg/L;qRT-PCR结果显示,小槐花提取物能显著抑制PR8流感病毒M与NP基因的mRNA表达（P<0.01）,也可显著下调病毒感染细胞的转录因子NF-κB p65、STAT3及炎性细胞因子IL-1β、TNF-α基因的表达水平,且其抑制作用与药物浓度正相关;免疫印迹法检测显示,100 mg/L的小槐花提取物极显著抑制了流感病毒M1蛋白的表达（P<0.01）。小槐花提取物具有较显著的体外抗流感病毒效果,此研究结果为从小槐花中鉴定具有抗流感病毒的确切药效成分奠定基础。     

顺铂对鼻咽癌细胞株端粒酶活性和凋亡的影响

目的：研究抗癌药顺铂对5株鼻咽癌细胞端粒酶活性和凋亡的影响．以探讨端粒酶活性水平与鼻咽癌的关系及顺铂诱导鼻咽癌细胞凋亡的可能机制，为端粒酶可能成为一种很好的鼻咽癌治疗靶点提供实验依据。方法：用TRAP—ELISA的方法定量检测5株鼻咽癌细胞在顺铂处理前后的端粒酶活性水平，观察细胞形态及生长状态．以流式细胞仪分析细胞周期的改变并检测凋亡。结果：5株鼻咽癌细胞端粒酶均呈阳性，其中LTRs—LMP细胞株端粒酶活性水平最高，高分化细胞株CNE—1端粒酶活性水平低于低分化细胞株CNE—2Z、HNE—2。经顺铂处理后5株鼻咽癌细胞端粒酶活性明显受抑制、细胞形态发生明显改变，出现细胞凋亡。结论：端粒酶的活化与鼻咽癌密切相关。临床常用化疗药物顺铂可能是通过在S期抑制端粒酶活性并诱导鼻咽癌细胞凋亡而发挥杭癌作用的。因此我们认为端粒酶可以作为鼻咽癌的一个治疗靶点。     

蒲公英皂苷体外抗炎作用及对NF-κB信号通路的调控

探讨蒲公英皂苷在脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞中的抗炎能力,并阐明其活性的基本分子机制。利用LPS刺激RAW264.7细胞建立体外炎症模型,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测蒲公英皂苷对RAW264.7细胞的增殖毒性,Griess reagent法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)的分泌,反转录聚合酶链式反应检测炎症细胞因子白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-αmRNA以及INOS mRNA的表达水平,酶联免疫吸附测定法测定IL-6和TNF-α的分泌量,Western blot检测IκB-α蛋白的磷酸化水平,用以研究蒲公英皂苷对NF-κB信号转导通路的抑制作用。结果表明:蒲公英皂苷能够抑制NO的分泌,显著抑制IL-6、TNF-α和INOS mRNA的表达并且抑制了IL-6和TNF-α的分泌。蒲公英皂苷显著上调了IκB-α的蛋白表达,并显著下调了p-IκB-α的蛋白表达且与蒲公英皂苷浓度成正比。蒲公英皂苷通过抑制NF-κB信号转导途径而发挥抗炎作用,蒲公英皂苷有显著的体外抗炎效果且抗炎效果与蒲公英皂苷的浓度呈剂量依赖性。