长途运输和体外保存对美利奴肉羊胚胎移植效果的影响

为研究远距离运输及鲜胚体外保存时间超过5h对胚胎移植效果的影响,将超数排卵供体羊与同期发情的受体羊两地饲养,并将取自供体羊的新鲜胚胎于体温下经直线距离超过300km的长途运输后,移植到受体羊体内。结果发现,供、受体羊经同期发情处理后,其发情率分别为100%和97.9%,供体羊输卵管冲胚获得胚胎数平均为13.5枚/只;受体羊产羔率为79.2%,略高于鲜胚直接移植的产羔率。由此可知,只要受体羊的营养状态良好、后期管理得当、胚胎体外保存方法适当,长途运输及体外保存时间超过5h对胚胎移植的效果无明显影响。     

牛体细胞中端粒酶组分的表达及端粒酶活性的研究

端粒酶是一种能够以自身的RNA组分为模板在染色体末端添加端粒重复序列的核酸蛋白复合体酶，主要由端粒酶RNA组分（TERC）与端粒酶逆转录酶组分（TERT）构成。通过对成年牛组织中端粒酶的这两种组分的表达情况及端粒酶活性状态进行检测，探讨牛端粒酶组分的组织特异性表达以及与端粒酶活性之间的关系。应用RT-PCR检测了成年牛的心脏、肾脏、肝脏及睾丸中TERC和TERT基因的mRNA表达情况，利用TRAP银染法检测各组织中的端粒酶活性状态。结果表明砸RC基因在这4种组织中均有表达，但转录水平在各组织之间有差异；TERT基因仅在睾丸中表达，在其他3种组织中均没有表达，端粒酶活性同样只在睾丸中检测到。由此可见牛端粒酶活性在体细胞中普遍受到抑制，仅在生殖腺中具有活性。端粒酶两种组分的转录是相互独立的，逆转录酶TERT组分是端粒酶活性的关键成分。     

牛fabp3和fabp4基因真核表达载体的构建 及在小鼠成肌细胞中的表达

【目的】分别构建牛fabp3和fabp4基因真核表达载体,并观察载体转染小鼠成肌细胞后基因的表达以及对内源fabp3和fabp4基因表达的影响,检测肉质性状形成相关基因在转基因细胞中的表达及对内源功能基因的影响。【方法】 以pDsRED质粒为骨架载体,分别将人肌红蛋白启动子与目的基因相连、CMV启动子与红色荧光蛋白报告基因相连构建肌肉特异性表达fabp3基因的载体pDsHF3和表达fabp4基因的载体pDsHF4;用脂质体瞬时转染小鼠成肌细胞,72 h后用2%孕马血清诱导成肌细胞向肌管的分化;利用real-time PCR技术检测转染前后成肌细胞中外源牛fabp3和fabp4基因和内源小鼠fabp3和fabp4基因的表达量。【结果】与对照组相比,小鼠成肌细胞分别转染pDsHF3和pDsHF4表达载体,24 h后外源牛fabp3和fabp4基因均获得高水平的表达,48 h后有所回落;而内源小鼠fabp3和fabp4基因在成肌细胞和诱导分化的肌管细胞中的表达均受到不同程度的影响。【结论】构建的真核表达载体能在成肌细胞中高效表达,外源牛fabp3或fabp4基因的转入能够影响小鼠成肌细胞及肌管中内源fabp3和fabp4基因的表达。     

牛4种组织中ZAR1基因表达及DNA甲基化修饰

ZAR1(Zygote Arrest 1)是母性效应基因,该基因在胚胎发育中起重要作用。本研究对成年牛组织中ZAR1基因表达情况及DNA甲基化状况进行了检测。利用RT-PCR检测成年牛心脏、肾脏、肝脏及睾丸中ZAR1基因mRNA的表达,结果ZAR1在睾丸中表达量较高,肾脏、心脏中较低,而在肝脏中不表达。选定该基因5′调控区中的11个CpG位点,利用亚硫酸盐测序PCR(bisulfite-sequencingPCR,BSP)检测其DNA甲基化状态,结果心脏中的甲基化程度明显高于其他3种组织。结果表明,DNA甲基化与牛ZAR1基因的组织特异性表达相关。     

小鼠FABP4基因启动子驱动红色荧光蛋白载体的构建及在牛体细胞中的表达

小鼠脂肪型脂肪酸结合蛋白(FABP4)的启动子/增强子元件是脂肪组织特异性启动元件,为了鉴定该元件在牛体细胞中的启动效果,首先以小鼠肝脏DNA为模板,通过PCR克隆得到5.9 kb的FABP4基因启动子片段,连入p MD19-T载体后进行酶切及测序鉴定,经Eco T 22I酶切去除非核心启动子区后精简为2.3 kb的片段,通过SacⅡ酶切将5.9 kb片段和2.3 kb片段的启动子连入红色荧光蛋白载体p Ds-Red 2-1的多克隆位点,构建为表达质粒p MF5.9-Red和p MF2.3-Red,利用脂质体法将上述载体分别转染牛脂肪间充质干细胞及牛胎儿成纤维细胞,24 h后实时定量PCR检测红色荧光蛋白转录水平。结果表明,克隆得到的5.9 kb小鼠FABP4启动子片段酶切及测序结果正确,与红色荧光蛋白载体相连的载体p MF5.9-Red和p MF2.3-Red酶切结果与预期相符,表达载体构建成功,实时定量PCR结果显示以上2种细胞在转染后24 h红色荧光蛋白均有表达,且p MF2.3-Red的转录水平是p MF5.9-Red的2倍以上。成功构建了小鼠FABP4启动子驱动红色荧光蛋白表达载体p MF5.9-Red和p MF2.3-Red,5.9 kb片段和2.3 kb片段均可驱动外源基因在牛体细胞中转录,且2.3 kb片段启动效率高于5.9 kb片段。