奶牛隐性乳房炎三种致病菌的多重PCR检测方法的建立

为建立快速并能同时检测无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌3种奶牛隐性乳房炎致病菌的方法,根据无乳链球菌16S rRNA基因、金黄色葡萄球菌NUC耐热基因、绿脓杆菌ETA基因序列并参考文献各合成一对特异性引物,通过对PCR反应各项参数的调整优化,建立多重PCR检测体系,并同时进行灵敏性试验和特异性试验。结果显示:该检测方法可以同时扩增出无乳链球菌270 bp、金黄色葡萄球菌153 bp和绿脓杆菌375 bp的特异性片段以及细菌16S rRNA 1 500 bp的通用片段,而对于其他的6种病原菌只能扩增出1 500 bp的通用片段,具有较强的特异性。三种特异性引物扩增条带与GenBank上的细菌基因序列同源性为99%。增菌培养24 h,该体系对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的最低灵敏度分别为8×10⁴、4×10⁴、1.5×10⁵ CFU·mL^-1。本研究建立的检测方法能够完成无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的快速检测,对于生产上奶牛隐性乳房炎的鉴别诊断和快速检测具有重大意义。     

双重PCR快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌

根据无乳链球菌的cfb基因和海豚链球菌16SrRNA基因序列,设计、合成2对引物,优化扩增条件,建立了快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌的双重PCR方法.用该方法扩增无乳链球菌和海豚链球菌,可分别获得474、296bp的特异性片段,扩增嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌等其他常见鱼病原菌无特异性片段.该方法可实现对无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,具较高的灵敏度,可检测到基因组含量分别为3.2×10-3ng/μL的无乳链球菌和3.0×10-2ng/μL的海豚链球菌.对采集自广东与海南两省养殖罗非鱼病鱼的11份病原样品进行检测,均可获得474bp片段,测序与BLAST分析结果表明,扩增到的序列均为无乳链球菌cfb基因序列,可从分子水平上确定这些样品为无乳链球菌,与生化鉴定结果一致.     

奶牛乳房炎无乳链球菌的分离鉴定与特异、快速检测方法

[目的]了解新疆奶牛乳房炎病例中无乳链球菌的感染状况和生物学特性,建立特异、快速检测方法.[方法]采集新疆4个不同地区规模化奶牛场乳房炎奶样,分别用鉴别培养基和绵羊血琼脂平板进行无乳链球菌分离培养、形态学观察、生化试验、PCR鉴定、致病性和常用抗生素敏感性试验.[结果]从检测出的139份乳房炎阳性奶样中分离出无乳链球菌24株.所分离菌株培养特性与生化反应符合该菌特性;依据无乳链球菌16S rRNA基因序列设计引物扩增所得PCR产物在405 bp处出现特异性条带;分离菌株对青霉素、氯霉素、庆大霉素、红霉素、万古霉素、克林霉素、头孢西丁、环丙沙星均敏感,对四环素、强力霉素、复方新诺明耐药.[结论]Granada选择性培养基培养和PCR扩增均可用于乳房炎奶样中无乳链球菌的特异、快速鉴定;新疆乳房炎奶样中无乳链球菌感染率为17.27;.     

基于nuc基因的奶牛乳房炎性金黄色葡萄球菌PCR检测方法的建立

基于PCR扩增的高效性,建立了以耐热核酸酶基因(nuc)为靶标基因特异性检测奶牛乳房炎性金黄色葡萄球菌的PCR方法。本实验从分离获得的205株染色为革兰阳性、形态为葡萄串状的菌株中随机选取50株进行16S rRNA基因测序和nuc基因扩增。结果显示,其中有40株葡萄球菌均可扩增出约279 bp的条带,其余10株葡萄球菌均未扩增出预期大小的条带。传统生化鉴定及16S rRNA基因测序结果表明,40株扩增出约279 bp条带的分离株均为金黄色葡萄球菌,未扩增出预期大小条带的10株菌均是葡萄球菌属的其它种。这一结果表明,nuc基因的PCR扩增可作为金黄色葡萄球菌特异性检测的分子标记。     

食品中克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)双重PCR检测方法研究

根据克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)16S rRNA基因以及局部大分子合成(MMS)操纵子特异序列设计2对引物,经反应体系和条件优化,建立了双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,Cronobacter spp.菌株PCR扩增均可见2条特异性条带,而其他菌株PCR扩增均为阴性。纯菌检测双重PCR的灵敏度为6.3×103 CFU.mL-1,而相对应单重PCR的灵敏度分别为6.3×101 CFU.mL-1和6.3×103 CFU.mL-1;人工污染的食品样品(奶粉、牛奶、鸡肉)在经过24 h增菌后,检测限均可达100 CFU.mL-1或100 CFU.g-1。在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)存在的条件下,双重PCR的检测限没有受到影响。表明本试验建立的双重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能克服食品样品基质及杂菌的干扰,可应用于食品中Cronobacter spp.的检测。     

利用多重PCR技术检测羊肉中掺杂狐狸肉的方法研究

本研究根据山羊、绵羊和狐狸线粒体16S rRNA基因间序列差异,设计特异性引物,其扩增片段大小分别为401、450 bp和300 bp,从而可在一个PCR反应中同时鉴别山羊、绵羊和狐狸三种源性成分,检测灵敏度高。     

动物性食品源弓形菌23S rRNA基因PCR检测方法的建立

建立了一种快速、准确检测弓形菌(Arcobacter)的PCR方法。根据弓形菌23S rRNA基因序列设计引物,对弓形菌标准菌株、弓形菌食品分离株及非弓形菌属菌株进行PCR扩增。结果表明,弓形菌标准菌株和35株弓形菌食品分离株扩增后均可得到688 bp的目的条带,11株非弓形菌属菌株均未见任何扩增条带,对弓形菌的最低检测限为1.12×103CFU/mL。该方法操作简单、检测周期短、灵敏度高、特异性好,可用于食品中弓形菌的快速检测。     

广西罗非鱼源无乳链球菌耐药性及其四环素耐药基因检测

[目的]研究分析广西罗非鱼源无乳链球菌的耐药性及其四环素类耐药基因,为指导罗非鱼无乳链球菌病的临床用药和揭示其耐药机制提供参考依据.[方法]采用二倍稀释法测定8种抗生素对广西罗非鱼源无乳链球菌的最小抑菌浓度(MIC),运用PCR检测菌株的四环素类耐药基因(tetM、tetO、tetL和tetS)携带情况,并以体外诱导法测定罗非鱼源无乳链球菌对多西环素耐药性的获得速率.[结果]37株广西罗非鱼源无乳链球菌对氨苄青霉素、多西环素、红霉素和土霉素均敏感,对硫酸新霉素和磺胺二甲嘧啶不敏感(已产生耐药性);仅从8株菌株中检出tetM基因,检出率21.6%(8/37),而tetO、tetL和tetS基因的携带率均为0,即广西罗非鱼源无乳链球菌仅存在tetM+tetO-tetL-tetS-和tetM-tetO-tetL-tetS-两种耐药基因型.经多西环素连续8代的体外传代诱导,6株携带tetM基因的罗非鱼源无乳链球菌MIC由0.24μg/mL上升至3.91μg/mL,即耐药性获得速率约16倍.PCR检测结果显示,各传代菌株均携带有tetM基因,且各传代菌株间的核甘酸相似性为100.0%.[结论]广西罗非鱼源无乳链球菌存在tetM+tetO-tetL-tetS-和tetM-tetO-tetL-tetS两种耐药基因型,对氨苄青霉素、多西环素、红霉素和土霉素仍较敏感,对硫酸新霉素和磺胺二甲嘧啶已产生耐药性.携带tetM基因的罗非鱼源无乳链球菌经体外诱导后对多西环素的耐药性大幅度提高,说明未达有效抑菌浓度时极易诱导无乳链球菌产生耐药性.     

奶牛隐性乳房炎乳房链球菌巢式PCR检测方法的建立

为研究巢式PCR检测奶牛隐性乳房炎链球菌的灵敏度,以本实验室从新鲜奶样中分离并经过生理生化鉴定的乳房链球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为研究对象,提取细菌DNA,采用巢式PCR技术,根据细菌16S rRNA序列保守区设计通用引物进行第1次PCR扩增,再在乳房链球菌16S rRNA保守区内的可变区设计特异引物对4种病原菌进行第2次PCR检测。结果表明:巢式PCR技术能检测出乳房链球菌16S rRNA保守区的可变区序列,与生理生化鉴定结果一致。该方法能快速有效检测出奶牛隐性乳房炎乳房链球菌。     

利用PCR和限制性酶切技术鉴别3种鳗鱼

根据日本鳗、欧洲鳗和美洲鳗3种鳗鱼的16S rRNA基因序列,设计特异性引物,进行16SrRNA基因的PCR扩增,然后对PCR产物进行ApaI酶切反应.结果显示,日本鳗和欧洲鳗的PCR产物均出现211 bp的特异性扩增条带,美洲鳗的PCR产物出现两条DNA条带;日本鳗的PCR产物经ApaI酶切产生大小为135 bp和76 bp的两条条带,而欧洲鳗的PCR产物经ApaI酶切没有变化.因此,利用该方法可鉴别出日本鳗、欧洲鳗和美洲鳗等3种鳗鱼.     

罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立

为建立准确快速的海豚链球菌鉴定方法,设计合成了海豚链球菌种特异性引物CM1/CM2,进行了其特异基因片段的PCR扩增、反应条件的优化及方法的特异性和敏感性试验;同时还进行了不同检测材料的比较及9份临床样品检测.结果表明,引物CM1/CM2只能从海豚链球菌中扩增到特异性基因片段,供试的其它9种水产常见病原菌PCR扩增均呈阴性;能够检测的最低细菌数在20～30个细菌;方法可直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织检测到该菌;另外,临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析结果一致.该方法弥补了传统细菌鉴定很难将该菌鉴定到种的缺点,并显著缩短了检测时间及降低了检测成本,具有较好的应用前景.     

罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立

为建立准确快速的海豚链球菌鉴定方法,设计合成了海豚链球菌种特异性引物CM1/CM2,进行了其特异基因片段的PCR扩增、反应条件的优化及方法的特异性和敏感性试验;同时还进行了不同检测材料的比较及9份临床样品检测.结果表明,引物CM1/CM2只能从海豚链球菌中扩增到特异性基因片段,供试的其它9种水产常见病原菌PCR扩增均呈阴性;能够检测的最低细菌数在20～30个细菌;方法可直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织检测到该菌;另外,临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析结果一致.该方法弥补了传统细菌鉴定很难将该菌鉴定到种的缺点,并显著缩短了检测时间及降低了检测成本,具有较好的应用前景.     

吉富罗非鱼组蛋白酶B基因克隆及无乳链球菌感染后的表达分析

【目的】探究组蛋白酶B基因（CtsB）在吉富罗非鱼感染无乳链球菌前后的表达差异,为深入研究罗非鱼抗无乳链球菌感染的免疫应答机制及后续通过SNP分子标记/基因组编辑技术快速获得吉富罗非鱼抗病新品种提供科学依据。【方法】通过RACE克隆罗非鱼CtsB基因cDNA全长序列,使用SMART、 Splign、 MEGA v6.0、 BoxShade及MegAlign等在线软件进行生物信息学及系统进化分析,并以实时荧光定量PCR检测吉富罗非鱼CtsB基因组织表达谱及无乳链球菌感染后CtsB基因的表达变化规律。【结果】吉富罗非鱼CtsB基因cDNA序列全长1746 bp,包括161 bp的5'端非编码区（5'-UTR）、 592 bp的3'端非编码区（3'-UTR）及993 bp的开放阅读框（ORF）,共编码331个氨基酸残基。基于CtsB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,吉富罗非鱼与奥利亚罗非鱼的亲缘关系最近,而与鲤鱼、大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎等物种相距较远。CtsB基因在吉富罗非鱼的肝脏、脾脏、鳃、前肾、脑、肠道、皮肤和肌肉等组织中均有表达,且以鳃组织中的相对表达量最高,是其他器官组织的2.0~3.0倍。吉富罗非鱼抗病家系和易感家系感染无乳链球菌后, CtsB基因在脾脏和肾脏中的相对表达量均显著上调 （P<0.05）,并于感染后50 h达峰值,且抗病家系的上调表达幅度大于易感家系。【结论】 CtsB基因在鱼类的进化过程中具有高度保守性,但在不同物种中的表达模式存在明显差异。CtsB基因是吉富罗非鱼的重要免疫因子,在抵御无乳链球菌入侵过程中发挥着重要的免疫作用,可作为罗非鱼抗病育种的SNP分子标记给予开发利用。     

无乳链球菌感染吉富品系尼罗罗非鱼的病理学研究

[目的]确定无乳链球菌侵染吉富品系尼罗罗非鱼的途径及靶器官,为罗非鱼抗病育种及无乳链球菌病疫苗的研发提供理论依据.[方法]分别采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染,然后采集感染罗非鱼的鳃、脾脏、肝脏和小肠组织进行病理形态学观察,并利用家兔抗无乳链球菌血清进行免疫组织化学定位,明确不同感染途径下无乳链球菌在鱼体内各组织中的分布规律及其浸染的靶器官.[结果]3种人工感染方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌,其中,腹腔注射和经口灌胃在感染2h后即出现病理变化,而体外浸泡感染方式出现病理变化的时间约在感染5h后,且病变程度较腹腔注射和经口灌胃的感染方式轻.免疫组织化学定位发现,腹腔注射组吉富品系尼罗罗非鱼的病原菌信号出现顺序为脾脏→肝脏和鳃→小肠,经口灌胃组的病原菌信号出现顺序为小肠→鳃和脾脏→肝脏,体外浸泡组的病原菌信号出现顺序为鳃→脾脏→肝脏和小肠.[结论]采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌,其对应的病原菌信号分别优先在脾脏、肠道和鳃组织出现.因此,自然养殖条件下防止养殖水体和食源被无乳链球菌污染是防控罗非鱼无乳链球菌病暴发的有效措施.     

罗非鱼致病性无乳链球菌的分离鉴定及药敏试验

【目的】对广西南宁市郊三塘镇某养殖场患病罗非鱼进行病原菌分离鉴定及药敏试验,旨在找出罗非鱼的发病原因,为该病的有效防治提供依据。【方法】用常规方法从患病濒死罗非鱼脑部分离病原菌,通过人工感染试验确定分离菌株的致病性,用API20 Strep生化鉴定系统和16S rRNA鉴定病原菌,并采用K-B纸片扩散法进行药敏试验。【结果】分离获得的4株革兰氏阳性球菌(GXN01、GXN02、GXN03和GXN04)对健康罗非鱼均有很强的致病性,是导致罗非鱼发病死亡的病原菌,经API20 Strep生化鉴定和16S rRNA鉴定均为无乳链球菌(Streptococcusagalactiae),与GenBank上已登录的无乳链球菌JQ039365、JQ039376、JQ990156、JQ039366、JF423948、HQ645984、GU217535菌株高度同源,同源性达99.2%~99.7%,4株分离菌株间也高度同源(99.9%)。药敏试验结果发现,4株无乳链球菌对先锋霉素VI、氧氟沙星、先锋必、盐酸沙拉沙星敏感,但对庆大霉素、氟哌酸、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶等具有耐药性。【结论】引起广西南宁市三塘某养殖场罗非鱼发病死亡的病原菌为无乳链球菌,可选用先锋霉素VI、氧氟沙星、先锋必、盐酸沙拉沙星等药物进行防治。     

尼罗罗非鱼干扰素诱导蛋白44基因克隆及表达分析

【目的】探索干扰素诱导蛋白44基因（ifi44）在尼罗罗非鱼各组织的分布特征及其响应无乳链球菌感染和聚肌胞苷酸［Poly（I:C）］刺激过程中的表达模式，为进一步揭示ifi44基因在鱼类免疫应答中的作用机制打下基础。【方法】克隆On-ifi44基因开放阅读框（ORF），通过ExPASy、TMHMM-2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析，根据单细胞转录组测序结果分析On-ifi44基因在细胞层面的分布情况，并采用实时荧光定量PCR检测On-ifi44基因在尼罗罗非鱼各组织中的表达分布特征及在无乳链球菌感染和Poly（I:C）刺激后的时序表达情况。【结果】 On-ifi44基因ORF序列全长1437 bp，编码478个氨基酸残基，其编码蛋白分子量为52.7 kD，理论等电点（pI）为4.97。On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域（1~157 aa）和1个GTP-bd结构域（197~322 aa），不含跨膜结构域。On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗非鱼ifi44氨基酸序列的相似性为97.94%；基于ifi44氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗罗非鱼ifi44氨基酸序列聚为一支，二者具有较近的亲缘关系。On-ifi44基因在尼罗罗非鱼的肠道、肝脏、鳃、皮肤、脾脏、体肾、胸腺、脑、头肾、肌肉、心脏等11个组织中均有表达，且主要在T细胞亚群表达；经无乳链球菌感染和Poly （I:C）刺激后，On-ifi44基因在尼罗罗非鱼脾脏、肾脏、头肾和肠道组织中的相对表达量均发生变化，且存在明显的时间依赖性。【结论】 On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域和1个GTP-bd结构域，进化保守且在不同物种间具有相似的生物学功能； On-ifi44基因在无乳链球菌感染和Poly（I:C）刺激后呈时间依赖性上调表达，表明ifi44基因作为重要的调节因子，参与了尼罗罗非鱼抗细菌感染、抗病毒增殖的免疫应答过程。     

内蒙古无乳链球菌耐药性及四环素耐药基因检测

为了解内蒙古地区隐性乳房炎无乳链球菌分离株耐药性及耐药基因,采集内蒙古不同地区的规模化养殖场隐性乳房炎乳样,采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法测试分离株对16种抗菌药物的敏感性,PCR方法检测其耐药基因。结果显示:无乳链球菌对大部分抗生素较敏感。对其有较强抑菌作用的药物为:青霉素G、头孢噻肟、头孢唑啉、阿莫西林、红霉素、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、林可霉素、呋喃妥因、万古霉素。其敏感性达到90%~100%。该菌株对四环素有较强的耐药性,耐药率达77.27%。PCR扩增四环素耐药基因tetM、tetO、tetK、tetL,结果显示22株无乳链球菌均含有tetM基因,其基因的检出率为100%。其中7株同时含有tetK基因,tetO、tetL基因未检出。     

罗非鱼养殖环境中益生菌的筛选

该研究从不同的罗非鱼养殖区域、养殖模式、养殖环境中分别采集样品,经前期处理后得到262株待测菌株。以无乳链球菌为指示菌株,利用琼脂扩散法筛选拮抗菌。通过安全性试验对初筛菌株进行复筛,同时进行16S rDNA分子鉴定。结果显示,初筛得到29株拮抗菌,其中6株对无乳链球菌安全,分属于芽胞杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属3个属。     

2011～2012年广西罗非鱼食源性致病菌及其药敏特性调查

[目的]了解广西罗非鱼食源性致病菌的种类及其药敏特性,为研究制定罗非鱼食源性疾病的综合防控措施提供参考依据.[方法]对2011～2012年采自广西罗非鱼主产区养殖场及市售罗非鱼样品（200份）进行沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、无乳链球菌、海豚链球菌和致病性嗜水气单胞菌等9种重要食源性致病菌分离,采用Biolog自动微生物鉴定系统对分离获得的食源性致病菌进行鉴定,并参照美国临床实验室标准化研究所推荐的纸片琼脂扩散（K-B）法进行药敏试验.[结果]所检测的9种食源性致病菌中除了未检出金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌外,其他6种食源性致病菌均有检出.养殖场罗非鱼样品的无乳链球菌和致病性嗜水气单胞菌检出率较高,分别为7.5％和5.0％,海豚链球菌、沙门氏菌、致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的检出率分别为3.3％、2.5％、1.7％和0.8％;市售罗非鱼样品仅检出无乳链球菌、海豚链球菌、致病性嗜水气单胞菌和沙门氏菌,检出率分别为2.5％、1.3％、1.3％和1.3％.检出的食源性致病菌对常用抗菌药物表现出不同的敏感药物谱和耐药谱,以对头孢哌酮的敏感率最高,达56.7％;对青霉素、新霉素和林可霉素的耐药率最高,均为63.3％.[结论]广西罗非鱼携带有以无乳链球菌和致病性嗜水气单胞菌为主的多种食源性致病菌,且检出的致病菌均存在多重耐药性.     

链球菌通用PCR检测方法的建立及应用

为建立链球菌快速检测方法,根据链球菌延伸因子EF-Tu基因设计合成1对通用引物,对链球菌属及其他属细菌进行PCR检测.结果表明,所设计的通用引物对猪链球菌2型和无乳链球菌均能扩增出1条大小为197 bp的特异性DNA条带,而对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、都柏林沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌均呈阴性反应;经对PCR产物进行测序分析表明,扩增片段与GenBank上链球菌相应序列的同源性达90%～98%;对链球菌DNA样本不同稀释度的检测显示,该PCR的最低检出量可达0.1 ng/mL;利用PCR检测方法对11株链球菌分离物进行检测,结果均能扩增出与预期大小相一致的目的条带,与传统生化鉴定结果符合率达到100%.这些结果表明,已成功建立了链球菌PCR检测方法,并可应用于临床链球菌的鉴定.