欧鳗嗜水气单胞菌的分离、鉴定和特性分析

2000年夏季福建地区许多鳗场养殖的欧洲鳗暴发以脱粘、败血为主要症状的疫病，从不同来源的濒死鳗鱼体内分离到4株细菌。细菌的形态学、生化分析和补充试验结果符合嗜水气单胞菌的各项指标，PCR检测4株分离菌均扩增出特异性的气溶素基因（aerA)209bp片段及胆酶基因（Lip)760bp片段，进一步证实这些分离菌为嗜水气单胞菌并存在毒力基因。人工造病实验结果表明，分离株M00081205①的菌体纯培养物和胞外产物对昆明小白鼠和欧洲鳗分别具有中等和高度的致病力，初步证实嗜水气单胞菌是欧鳗夏季爆发性疫病的病原之一。     

鸡传染性喉气管炎病毒gC基因克隆测序

参考GenBank收录的传染性喉气管炎病毒gC基因序列设计并合成一对引物,以ILTV河南长葛株DNA为模板,PCR扩增出一条1270bp的特异性条带,并克隆至pGEM—T载体上。经PCR扩增、酶切鉴定,得到含gC基因重组质粒,并对重组阳性质粒进行序列测定,测序结果为1550bp。     

西班牙根结线虫rDNA特性及其检测方法

通过对rDNA的ITS区和IGS2区进行PCR扩增并对产物测序,比较分析了西班牙根结线虫与中国4种常见的南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫群体rDNA的ITS区和IGS2区的序列差异,选择限制性内切酶TaqⅠ对IGS2区的PCR扩增产物进行酶切,获得了西班牙根结线虫的554 bp的特异性条带.表明用此方法可以明显将西班牙根结线虫与其他4种常见的根结线虫群体区分开,其灵敏度可达到单条根结线虫二龄幼虫.     

肉制品中羊源性成分PCR检测方法的建立及其应用

根据羊特异性线粒体DNA片段,设计合成一对引物,并以生、熟羊肉为材料,建立了肉制品中羊源性成分的PCR检测方法,并用于生、熟羊肉的鉴定。PCR扩增产物DNA片段大小为295 bp。用Sau3AⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定,酶切产物为204 bp和91 bp。PCR产物和酶切产物的片段大小与预期目标相符,其检测灵敏度达到0.225 pg DNA。合成的羊源性DNA引物可以扩增出羊肉的目的 DNA片段,而对马、狗、驴、兔和猪等14种动物DNA无扩增效果。利用该法对83份羊肉制品进行鉴定,检出率为100%。结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定。     

西班牙根结线虫rDNA特性及其检测方法

通过对rDNA的ITS区和IGS2区进行PCR扩增并对产物测序,比较分析了西班牙根结线虫与中国4种常见的南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫群体rDNA的ITS区和IGS2区的序列差异,选择限制性内切酶TaqⅠ对IGS2区的PCR扩增产物进行酶切,获得了西班牙根结线虫的554 bp的特异性条带.表明用此方法可以明显将西班牙根结线虫与其他4种常见的根结线虫群体区分开,其灵敏度可达到单条根结线虫二龄幼虫.     

利用PCR技术快速检测玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii)

根据玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartiisubsp.stewartii)ITS基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对玉米细菌性枯萎病菌和非玉米细菌性枯萎病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应.结果显示,玉米细菌性枯萎病菌的PCR产物出现301 bp的特异性扩增条带,而非玉米细菌性枯萎病菌均未出现扩增条带;其PCR检测的灵敏度为612 pg/μL.因此PCR技术是一种特异、灵敏、快速检测玉米细菌性枯萎病菌的方法.     

橡胶树SAM-SSR体系的优化

以橡胶树品种热研88-13为试材,研究了橡胶树SAM.SSR法中各个过程(酶切、连接、抑制性和预扩增)中各因素对SAM法结果的影响.实验结果表明:5UMse I和5U Pst I双酶切1 h为最合适酶切浓度、方式和时间:100～300 ng为适宜的DNA模板浓度;合适的连接温度和时间为16℃连接过夜;连接产物和抑制性PCR产物分别稀释20倍,为抑制性PCR和预扩增PCR的适宜模板浓度.SAM扩增产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测,结果显示,扩增条带分布在200～750 bp之间,能够满足建立橡胶树SSR基因组文库的需要.     

2种PCR方法扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列比较

比较了扩增已知序列5’侧翼序列的2种PCR方法.方法一是反向PCR (IPCR),以大豆基因组酶切后的DNA片段自身环化产物做模板,用2对特异引物反向扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列.方法二是热不对称交错PCR(rAIL- PCR),以大豆基因组DNA为模板,用3个巢武特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环.IPCR和TAIL- PCR 2种试验方法分别扩增获得438 bp和867 bp特异产物.经测序发现:2片段两侧均含有设计的引物,其部分序列均与已知序列相一致,两者也有部分序列完全相同,但TAIL- PCR技术简单,重复性好,能够在短时间内获得目标片段,TAIL-PCR技术在克隆侧翼序列时优于IPCR.     

采用PCR-RFLP法鉴别IBDV强毒BC6/85株和弱毒B87株

选取传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒力代表株BC6/85和弱毒力代表株B87为研究对象,根据VP2基因保守区设计一对通用引物和两个限制性内切酶位点,分别扩增两个毒株的VP2基因,然后进行BamHⅠ和PstⅠ酶切,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)分析酶切产物,并进行特异性、敏感性和重复性检测.结果表明:所设计的引物均可扩增两个毒株的VP2基因,大小约856 bp;经BamHⅠ和PstⅠ酶切后,BC6/85株的PCR产物被BamHⅠ和PstⅠ切出166、242和449 bp大小的3个片段,而B87株仅被PstⅠ切出242和615 bp大小的2个片段,且重复性好,特异性强.可见,采用PCR-RFLP分析IBDV VP2基因的方法操作简单,是一种能够快速鉴别IBDV强、弱毒株的可靠方法.     

浓缩苹果汁中3种污染菌多重PCR检测方法的建立

根据大肠杆菌的β葡糖醛酸酶基因(uid)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)和金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc),分别设计3对特异性引物,通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性以及扩增条件进行优化.结果表明:3对引物分别能扩增出147bp、570bp和280bp的特异性条带,反应条件优化后,3种目的菌在104 CFU/mL时均可同时扩增出较清晰条带(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在103 CFU/ml浓度下仍然可见到条带),仅沙门氏菌的检测比单基因PCR低一个稀释度,人工模拟果汁污染试验结果稳定.该方法操作简单、快速、特异性强,灵敏度高,能够实现对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种菌的快速诊断检测和生产过程监控.     

基于16S rDNA序列和RFLP分析的病鳗分离菌株鉴定

结合16S rDNA基因序列和限制性片段长度多态性（RFLP）的分析方法,通过与GenBank库中已递交的细菌16S rDNA基因序列进行同源性比较,对分离自发病鳗鲡（欧洲鳗鲡,日本鳗鲡和美洲鳗鲡）的30株细菌进行初步鉴定和分类.结果表明,这些细菌可大致分为气单胞菌属（Aeromonas sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、邻单胞菌属（Plesiomonas sp.）、克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter sp.）、不动杆菌属（Acinetobacter sp.）和肠杆菌属（Enterobacter sp.）等7个菌属.分析认为,部分分离菌株可能是引起鳗鲡病害的疑似致病性菌株.     

鳗鲡幼苗种类的DNA指纹鉴定

养殖鳗鲡种苗来源日趋多样,确定鳗苗种类是决定养殖成败的关键因素之一。应用鳗鲡属鱼类mtDNA COI基因的保守序列设计一对特异性引物,对21批次,共109个白苗期鳗鲡样品进行种类鉴定。结果显示,应用该引物可以在所采集到的鳗鲡样品中扩增出652bp特异性基因片段,将样品COI基因序列与BOLD数据库中鳗鲡COI基因标准序列进行比对,共鉴定得7个种类归属,分别为日本鳗鲡A.japonica、美洲鳗鲡A.rostrata、欧洲鳗鲡A.anguilla、花鳗鲡A.marmorata、莫桑比克鳗鲡A.mossambica、吕宋鳗鲡A.luzonensis和太平洋双色鳗A.bicolor pacifica。对COI基因序列进行聚类分析,得到7个有很高节点支持率的主要类群。结果证实mtDNA COI基因在鳗鲡种类鉴定上具有很好的实用性。此外,在种类的鉴定中发现其中1批次的样品定种错误,有1个批次的鳗鲡样品中存在有2个种类的混杂,提示在实际的苗种养殖及交易中,对鳗鲡的种类鉴定上仍存在一定的错误和混杂,有必要引入DNA分子标记技术进行更加方便和准确的鉴定。     

欧洲鳗鲡与日本鳗鲡的染色体组型比较

采用ＰＨＡ体内注射法,以肾组织为材料,结合扫描电镜研究,对区洲鳗鲡、日本鳗鲡的染色体组进行了比较,结果是：欧洲鳗鲡２ｎ＝３８,中部着丝点染色体为６对,近中部着丝点染色体为３对,端部着丝点染以体为１０对,染色体总臂数（ＮＦ）为５６,ｔ３染爸体上有随体。日本鳗鲡２ｎ＝３８,中部着丝点染色体数为５对,近中部着丝点染色体为５对,端产着丝点染色体为９对,染色体总臂数（ＮＦ）为５８。对欧洲鳗鲡、日本鳗鲡的染色     

云南西盟蔗区发现检疫性病害甘蔗白叶病

研究旨在明确2018年在云南西盟蔗区发现的甘蔗病害是否为植原体引起的甘蔗白叶病。使用植原体16S rRNA基因序列通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2对10份采自云南西盟蔗区的疑似甘蔗白叶病样品进行巢氏PCR检测,并将巢氏PCR 产物进行克隆测序和序列分析。巢氏PCR结果表明,所有10份样品均能扩增得到1240bp左右的片段。测序结果表明所有获得的10条16S rRNA基因序列大小均为1247bp,序列间的核苷酸一致性为100%。BLASTN分析表明从病株扩增到的所有核苷酸序列与先前云南临沧甘蔗白叶病植原体分离物LC7和LC9的16S rRNA基因序列(Genbank登陆号：KR020691和KR020692)的核苷酸序列一致性为100%。虚拟RFLP分析表明西盟分离物的16S rRNA基因序列的酶切图谱与16SrXI-B亚组植原体相同。本研究结果表明云南西盟蔗区发现的甘蔗病害为16SrXI-B亚组植原体引起的甘蔗白叶病。     

不同品种猪生长激素基因的PCR-RFLPs分析

采用PCR-RFLPs技术，对香猪、上海白猪、大约克夏猪生长激素基因-119～＋715区域共834bp片段的扩增产物分别用ApaI、DraI、MspI三种限制性内切酶检测酶切位点的多态性。结果显示：ApaI酶切时．三个品种的猪都产生了3种基因型（AA、BB和AB），BB基因型的频率以大约克夏猪最高．AB基因型的频率以香猪最高．三个猪种间基因型频率、等位基因频率的差异不显著（P〉0．05）；DraI酶切时．各品种猪均未呈现酶切位点的多态性；MspI酶切时，仅大约克夏猪表现出2种基因型（CC、CD），香猪、上海白猪未产生酶切位点多态性。结论：AB基因型的频率以香猪为最高，它可能是小型猪的有利基因型；在香猪和上海白猪中DraI和Mspl酶切位点的多态性比较贫乏。     

山羊痘病毒P32基因的PCR—RFLP分析

根据羊痘病毒基因组设计引物,建立了检测羊痘病毒P32基因的PCR方法,并扩增了疫苗毒株、标准毒株、贵州分离株的P32基因;应用生物学软件对山羊痘和绵羊痘病毒P32基因的酶切位点进行分析,选择合适的限制性内切酶对P32基因进行酶切.结果表明,以SDS-蛋白酶K法提取的病毒DNA在含量和纯度上均高于Trizol法,更有利于PCR扩增;所建立的PCR方法对细胞感染物及山羊痘疹样本均能扩增出特异性的目的DNA条带;软件分析选择限制性内切酶Hinf I对羊痘病毒P32基因的PCR产物进行酶切鉴定,可以有效区分山羊痘病毒和绵羊痘病毒.     

猪NCOA1基因PCR-RFLP多态性分析（摘要）（英文）

[目的]研究猪NCOA1基因的PCR-RFLP多态性,为猪的分子育种和标记辅助选择提供理论依据。[方法]以81头山东寿光六和原种猪场的长白猪为研究对象,采取常规酚-氯仿抽提法从猪耳组织提取基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增获得440 bp的NCOA1基因目的片段,利用限制性内切酶RsaⅠ对PCR产物进行酶切和琼脂凝胶电泳检测,并计算各等位基因频率和基因型频率。[结果]琼脂糖电泳检测酶切产物出现3种基因型：AA型（1条带：440 bp）、AB型（3条带：440、282、158 bp）、BB型（2条带：282、158 bp）;基因型频率分别为0.54、0.43和0.03;A和B 2个等位基因的基因频率分别为0.76和0.24。[结论]该研究猪群中,A为优势等位基因,AA基因型频率较高。     

猪NCOA1基因PCR-RFLP多态性分析

[目的]研究猪NCOA1基因的PCR-RFLP多态性,为猪的分子育种和标记辅助选择提供理论依据。[方法]以81头山东寿光六和原种猪场的长白猪为研究对象,采取常规酚-氯仿抽提法从猪耳组织提取基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增获得440bp的NCOA1基因目的片段,利用限制性内切酶RsaⅠ对PCR产物进行酶切和琼脂凝胶电泳检测,并计算各等位基因频率和基因型频率。[结果]琼脂糖电泳检测酶切产物出现3种基因型：AA型（1条带：440bp）、AB型（3条带：440、282、158bp）、BB型（2条带：282、158bp）;基因型频率分别为0.54、0.43和0.03;A和B2个等位基因的基因频率分别为0.76和0.24。[结论]该研究猪群中,A为优势等位基因,AA基因型频率较高。     

高体革鯻线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段的克隆与序列分析

[目的]为高体革鯻的遗传资源、物种间的亲缘关系和系统进化等研究提供一定的生物学依据。[方法]采用PCR扩增和序列测定等技术,对高体革鯻线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段进行初步研究。[结果]经PCR扩增和测序,分别得到16S rRNA和COI基因片段的碱基序列,其中16SrRNA基因片段的大小为791 bp,碱基A、T、G、C的含量分别为31.6%、21.4%、20.4%和26.7%;COI基因片段的大小为631 bp,碱基A、T、G、C含量分别为27.7%、23.6%、29.8%和18.9%。在这2个基因片段中,GC含量均低于AT含量,AT/GC分别为1.13和1.05。[结论]通过对高体革鯻16S rRNA和COI2个基因片段遗传特征的研究,发现其种内变异比较低,在3个样本中16S rRNA基因片段序列完全一样,COI基因片段也完全一样,说明高体革鯻的这2个基因都非常保守。     

6个地方猪品种(类群)GH基因的基因型分布研究

采用PCR-RFLP技术对6个地方品种(类群)GH基因-119bp至+486bp区域进行扩增,分别用内切酶ApaⅠ和Hin6Ⅰ检测其多态性。结果表明:ApaⅠ酶切产生2个等位基因A和B,3种基因型AA,AB和BB,AA为优势基因型,A为优势等位基因;Hin6Ⅰ酶切产生3个等位基因C2,C3和C4,4种基因型C2C3,C2C4,C3C4和C4C4,C4C4为优势基因型,C4为优势等位基因。ApaⅠ和Hin6Ⅰ酶切基因型在猪群体间的分布不均匀,且差异都达到极显著水平(P<0.01)。