ISSR-PCR技术及其在水产生物遗传多样性研究中的应用

简单重复序列间扩增(Inter-simple sequence repeat PCR,ISSR-PCR)是基于微卫星序列创建的分子标记方法,具有中性、量大的优点,并以重复性好、操作简单、多态性丰富及适合大样本基因组DNA的检测而被广泛应用于动植物种质资源、种群遗传多样性、标记辅助选择、性状分析与种系发生学等方面的研究.文章对ISSR-PCR技术的原理、方法、特点及其在水产生物遗传多样性研究中的应用现状和前景进行综述,以期为ISSR-PCR技术在水产生物遗传多样性研究中的有效应用提供理论参考.     

山瑞鳖塞氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药物敏感性研究

从患致死性传染病的山瑞鳖(Palea steindachneri)组织中分离到一株细菌(YL090422),对该菌形态、生理生化特征及致病性进行分析,并用BIOLOG自动微生物鉴定系统及16S rDNA序列分析对其进行了鉴定。结果显示:该菌具有较强的致病性,且为发酵型革兰氏阴性短杆菌,无芽胞及荚膜;具有对葡萄糖、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、西蒙氏柠檬酸盐、丙二酸盐、卫茅醇、吲哚、动力等反应呈阳性,对氧化酶、赖氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶、V-P反应等呈阴性的特点。BIOLOG自动微生物鉴定系统显示该菌为塞氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)。16S rDNA序列分析得到1条长度为1464bp的核苷酸序列(GenBank登录号为GU726186),并显示该分离株与塞氏柠檬酸杆菌(C.sedlakii)的同源性达99.9%,且在系统发育树上与C.sedlakii聚为一支。鉴定结果确认菌株YL090422为塞氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)。药敏试验结果显示:该菌对供试16种抗菌药物中的阿米卡星等3种药物敏感,对头孢哌酮等3种药物中度敏感,对氨苄青霉素等10种抗生素均存在不同程度的耐药。     

黄喉拟水龟松鼠葡萄球菌16S rDNA的序列测定和系统进化分析

从患病的黄喉拟水龟肝脏、肾脏分离到1株葡萄球菌（YLD81101）,经人工感染实验证实其为该病的病原菌。为了从分子水平上对其进行分类学鉴定,采用扩增细菌16S rDNA的通用引物对该菌的16S rDNA进行PCR扩增、克隆及序列分析。结果扩增出长约1．5kp的目的片段,测序得到1条长度为1515bp的核苷酸序列（GenBank登录号GQ261178）。核苷酸相似性分析表明,所得序列与GenBank公布的松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciud,S．sciuri）CTSP9菌株16S rDNA核苷酸序列相似性最高（99．9％）。同时,用与该序列相关性较高的S．sciuri及常造成动物葡萄球菌病的S．aureus S、saufeuss．bsp．anaerobius、S.gallinarum、S.hyicus代表菌株构建的系统发育进化树显示,菌株YL081101与S.sciuri代表株聚为一簇。上述研究证实,分离菌株YL081101为松鼠葡萄球菌。     

基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法

[目的]建立一种能扩增dnaJ基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持.[方法]以弧菌dnaJ基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dnaJ基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性.[结果]优化后的PCR反应体系50.0 μL:2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各2.0 μL,DNA模板5.0 μL,灭菌水补足至50.0 μL.扩增程序:94℃预变性3 min;94℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min.该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/mL.应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dnaJ基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dnaJ基因序列相似度为98.2%~99.9%.[结论]基于dnaJ基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dnaJ基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段.     

采用主成分分析法评价廉州湾贝类养殖区水质状况

为了解广西廉州湾贝类养殖区水质状况并指导渔业生产,借助SPSS软件,分析了2013—2015年该养殖区的水温、溶氧(DO)、化学耗氧量(COD)、溶解态无机磷(DIP)、溶解态无机氮(DIN)、石油类、汞(Hg)和叶绿素-a(Chl-a)等8项水质因子。采用主成分分析法筛选对养殖区影响较显著的因子来综合评价水质状况。结果显示,在产卵期(5月)和高渔获期(10月)可以各提取占总方差89.9%、92.9%的前4个主成分来计算综合评价函数得分,2013—2015年各监测期水质综合得分依次是0.220、-0.211、0.759、1.028、-0.977、-0.817,分值高低反映水质污染程度。2013年两个监测期的水质均属于III类,2014年两个监测期的水质均属于IV类,2015年产卵期水质属于I类,2015年高渔获期水质属于II类。由此可知,养殖区水质综合状况不稳定,年际间变化较大,曾出现Hg超标情况,污染较严重的是DIP、DIN和Chl-a。因此,养殖区应加强码头日常作业及沿岸工业排污口管理,同时应控制生活污水、农业废水排入,合理规划养殖规模,防止贝类养殖自身污染。     

毛细管电子捕获气相色谱法同时测定水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留

采用乙酸乙酯提取目标物,正己烷脱脂,微波辅助衍生化,建立了能同时测定水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留量的毛细管电子捕获气相色谱法（GC—ECD）。加标回收实验结果显示,氯霉素在1．0-200．0μg／L范围内、甲砜霉素和氟甲砜霉素在5．0～200．0μg/L范围内成良好的线性,相关系数均大于0．996;氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的检出限分别为0．1、0．2和0．2μg／kg,回收率在79．2％-88．0％之间,相对标准偏差在2．0％-4．1％之间。表明该方法定性定量准确、检出限低、重现性好、省时省力,可以满足水产品中3种氯霉素类药物的多残留安全检测。     

微波消解石墨炉原子吸收法测定水产品中铅的研究

采用微波消解进行样品前处理,以磷酸二氢铵作为基体改进剂,建立了分析水产品中铅含量的石墨炉原子吸收法,并对样品前处理方法和检测条件进行探讨与优化。结果表明,通过添加基体改进剂,仪器的响应值显著增加;样品铅浓度范围在0—50wg／L之间时,铅浓度与其吸光度呈良好的线性关系,相关系数为r=0．9990。利用国家标准物质牡蛎和对虾验证了方法的准确度与精密度,测定值在标准物的允许误差范围内,相对标准偏差分别为2．7％和3．3％,回收率分别为96．2％、94．8％和106．0％、96．5％。表明该方法具有简便、快捷、灵敏度高、准确可靠等优点,适合水产品中铅含量的检测。     

山瑞鳖嗜水气单胞菌感染的诊断及防治

从患病山瑞鳖的肝脏、肺脏分离到1株细菌,对该菌的形态特征、生理生化进行分析,初步鉴定为嗜水气单胞菌。采用BioFosun-Ⅰ微生物鉴定系统对该菌进一步鉴定,结果显示为嗜水气单胞菌,可能性概率（PROB）为99%,相似性指数（SIM）和位距指数（DIS）分别为0.989和0.099。综合形态特征、生理生化特点及微生物鉴定系统鉴定结果,可将从发病山瑞鳖分离到的病原鉴定为嗜水气单胞菌。人工感染试验表明,该嗜水气单胞菌是引起山瑞鳖发病的病原且具有高度致死性;药敏试验结果则表明,该菌对头孢哌酮、阿米卡星、氧氟沙星、恩诺沙星4种药物敏感;选用头孢哌酮和恩诺沙星对病鳖进行治疗,可获得较好的治疗和控制效果,为今后山瑞鳖养殖生产中更有效地防制由该菌引起的疾病提供参考。     

BIOLOG自动微生物鉴定系统在水产动物病原菌检测中的应用

[目的]了解BIOLOG自动微生物鉴定系统对水产动物病原菌鉴定结果的可靠性,为水产动物细菌性疾病的诊断提供参考。[方法]选用BIOLOG自动微生物鉴定系统对9株分离自发病水产动物的病原菌进行鉴定,同时采用16S rDNA序列分析对其中的4株进行鉴定,比较2种鉴定结果的符合率。[结果]采用自动微生物鉴定系统对9株病原菌进行鉴定均取得良好结果,采用16S rDNA序列分析对4株病原菌进行鉴定的结果与应用自动微生物鉴定系统所得结果完全一致,二者符合率为100%。[结论]应用BIOLOG自动微生物鉴定系统对水产动物病原菌进行鉴定具有操作简便、快速、准确等特点,是实验室鉴定水产动物病原菌的一种可行方法。     

Taura综合征病毒套式RT—PCR检测方法的建立及应用

Taura综合征病毒（TSV）是世界动物卫生组织（OIE）目录规定的水生动物二类疫病病原体。本研究在RT—PCR方法检测TSV行业标准的基础上，优化建立了能更准确检测TSV的套式RF—PCR。特异性和敏感性试验结果表明，该套式RT—PCR能对2个试验用TSV毒株的RNA进行扩增，并得到与预期大小一致的231bp的扩增产物，而其它2种对虾病原则无相同大小的特异性扩增产物出现；所建立的套式RT—PCR的灵敏度大约为常规RT—PCR的10。倍，最低可检测到10fg的TSVRNA。分别应用两种RT—PCR方法对180份分别来自广西沿海不同对虾养殖场的对虾临床样品进行检测，其中套式RT—PCR共有52份检出TSV，而常规RT—PCR仅有23份栓出TSV。表明所建立的套式RT—PCR提高了TSV的阳性检出率，较普通的常规RT—PCR有更大的应用价值和意义。