153种中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的抑制活性研究

【目的】研究中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的抑菌活性,为生产中罗非鱼链球菌病害的防治提供参考。【方法】采用琼脂扩散法,测定153种中草药乙醇提取物对罗非鱼(Tilapiasp.)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(S.iniae)的体外抑菌作用,并采用二倍稀释法测定中草药乙醇提取物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。【结果】153种中草药中,博落回(Macleaya cordata)、十大功劳(Mahonia fortunei)、三颗针(Berberis spp.)、紫草(Lithospermum erythrorhizon)、田七须(Panax notoginseng)、补骨脂(Psoralea corylifolia)、田基黄(Hypericum japonicum)和五倍子(Galla chinensis)提取物对无乳链球菌表现出了明显的抑制活性,其中博落回的抑菌效果最显著,抑菌圈直径为(25.1±0.6)mm;博落回、千斤拨(Flemingia philippinensis)、田七须、甘草(Bidens bipinnata)、田基黄、败酱草(Patrinina villosa)、紫草、苦参(Sophora flavescens.)、补骨脂、北五味子(Schisandra chinensis)、五倍子、鬼针草(Bidens bipinnata)、虎刺(Damnacanthus indicus)、三颗针、翠云草(B.bipinnata)、羌活(Notopterygium incisum Ting ex)、香薷(Elsholtzia patrini Garcke)对海豚链球菌具有明显的抑菌活性,其中博落回的抑菌作用最强,抑菌圈直径为(24.3±1.1)mm。对抑菌活性较强的中草药的MIC和MBC进行了测定,结果表明,三颗针和博落回提取物的抑菌和杀菌效果均较好。三颗针、博落回对无乳链球菌和海豚链球菌的MIC和MBC分别为0.31,0.63;0.63,1.25和1.25,2.50;0.94,1.88mg/mL。【结论】博落回、紫草、田基黄、补骨脂、三颗针、田七须和五倍子对无乳链球菌和海豚链球菌均具有较好的抑菌效果。     

卵形鲳鲹感染无乳链球菌与海豚链球菌的研究

于2011年8月对广西北海疑似链球菌感染的卵形鲳鲹Trachinotus ovatus进行病原分离鉴定,经人工感染试验,确定分离的两株病原菌(编号为TSG002和TSG004)为卵形鲳鲹的致病菌,然后对两株病原菌进行形态学、生理生化特征、16S rRNA基因序列和二重PCR快速检测综合鉴定,构建系统进化树,最后对两株菌进行药敏分析。根据染色形态特征和二重PCR快速检测,初步鉴定菌株TSG002和TSG004分别为无乳链球菌和海豚链球菌,菌株TSG002和TSG004的16S rRNA基因序列(登录号分别为KF826095和KF826094)分别与无乳链球菌ATCC13813 strain JCM 5671基因(登录号NR040821.1)和海豚链球菌ATCC29178基因(登录号AF335572.1)的相似性最高,均达99%。药敏试验结果表明,两株菌对头孢曲松、头孢呋辛、头孢哌酮、恩诺沙星、氧氟沙星、阿莫西林、多粘菌素B、头孢噻吩和头孢他啶均敏感。研究表明,感染无乳链球菌和海豚链球菌的卵形鲳鲹可发病死亡,在病鱼中同时分离到两种链球菌尚属首例。     

双重 PC R检测罗非鱼源无乳链球菌方法的建立

根据罗非鱼源无乳链球菌16S rRNA 基因和sip基因序列,设计、合成2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,建立快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。该方法扩增无乳链球菌可获得1305 bp和121 bp 2个特异性片段;对6株链球菌属的菌株进行特异性分析,仅无乳链球菌能扩增出16S rRNA 基因和sip基因2条特异性条带,而海豚链球菌无条带检出;经灵敏度试验,可检测到无乳链球菌菌株070717LL的最小量为1.05＆#215;10^2 CFU ;同时,双重PCR可以检测出无乳链球菌菌株070717LL人工感染的罗非鱼脾、脑、肾组织中细菌DNA ,特别是脾脏和肾脏组织的样品检测效果好。结果证明所建立的方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对罗非鱼源无乳链球菌病的流行病学调查。     

内蒙古无乳链球菌耐药性及四环素耐药基因检测

为了解内蒙古地区隐性乳房炎无乳链球菌分离株耐药性及耐药基因,采集内蒙古不同地区的规模化养殖场隐性乳房炎乳样,采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法测试分离株对16种抗菌药物的敏感性,PCR方法检测其耐药基因。结果显示:无乳链球菌对大部分抗生素较敏感。对其有较强抑菌作用的药物为:青霉素G、头孢噻肟、头孢唑啉、阿莫西林、红霉素、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、林可霉素、呋喃妥因、万古霉素。其敏感性达到90%~100%。该菌株对四环素有较强的耐药性,耐药率达77.27%。PCR扩增四环素耐药基因tetM、tetO、tetK、tetL,结果显示22株无乳链球菌均含有tetM基因,其基因的检出率为100%。其中7株同时含有tetK基因,tetO、tetL基因未检出。     

应用PCR技术检测患乳房炎奶牛生乳中的无乳链球菌

以无乳链球菌特异性STRA-Agl-23-1D基因序列为模板,设计、合成了一对引物,运用PCR技术从12个患有奶牛乳房炎的奶牛奶样中扩增得到9个大小为360 bp的DNA产物;阴性样品中未扩增到产物。测定了其中2个DNA片段的核酸序列,确定为无乳链球菌的STRA-Agl-23-1D基因。     

奶牛乳房炎无乳链球菌的分离鉴定与特异、快速检测方法

[目的]了解新疆奶牛乳房炎病例中无乳链球菌的感染状况和生物学特性,建立特异、快速检测方法.[方法]采集新疆4个不同地区规模化奶牛场乳房炎奶样,分别用鉴别培养基和绵羊血琼脂平板进行无乳链球菌分离培养、形态学观察、生化试验、PCR鉴定、致病性和常用抗生素敏感性试验.[结果]从检测出的139份乳房炎阳性奶样中分离出无乳链球菌24株.所分离菌株培养特性与生化反应符合该菌特性;依据无乳链球菌16S rRNA基因序列设计引物扩增所得PCR产物在405 bp处出现特异性条带;分离菌株对青霉素、氯霉素、庆大霉素、红霉素、万古霉素、克林霉素、头孢西丁、环丙沙星均敏感,对四环素、强力霉素、复方新诺明耐药.[结论]Granada选择性培养基培养和PCR扩增均可用于乳房炎奶样中无乳链球菌的特异、快速鉴定;新疆乳房炎奶样中无乳链球菌感染率为17.27;.     

无乳链球菌SIP基因的克隆和原核表达

目的重组表达无乳链球菌表面免疫相关蛋白(Surface immunogenic protein,SIP)基因,为进一步免疫学研究提供目标蛋白.方法用PCR的方法从石河子分离株的基因组DNA中扩增出SIP基因,用T/A克隆法将其插入PBST载体,并构建原核表达载体pET-32a( )-SIP.用BL21(DE3)/pET系统表达Trix-SIP融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物.结果PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中无乳链球菌(DQ650634)的SIP的基因序列同源性为98.62%.SDS-PAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET-32a( )-SIP总蛋白中出现一条相对分子质量为71KDa的新蛋白带.West-ern blot分析显示,SIP蛋白可与无乳链球菌多克隆抗血清发生特异性反应.结论已成功表达SIP,为SIP在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础.     

无乳链球菌对罗非鱼粘液的粘附特性

利用间接ELISA方法研究罗非鱼不同部位的粘液、作用时间、温度、p H及盐度等因子对无乳链球菌粘附作用的影响。结果表明:无乳链球菌对罗非鱼不同部位粘液的粘附能力受温度、粘附时间和p H值影响较大,受盐度影响较小。孵育温度为35℃、孵育时间为120 min时,无乳链球菌对肠道粘液的粘附能力最强,粘附量达到4.052×10~7cfu·m L~(-1);其次是体表粘液,粘附量为6.480×10~6cfu·m L~(-1);鳃粘液的粘附能力最弱,为2.825×10~6cfu·m L~(-1)。当孵育时间少于180 min时,粘附量与孵育时间呈正相关;粘附量在35℃下孵育180 min时,趋于饱和,达到5×10~8cfu·m L~(-1)。无乳链球菌对不同部位粘液粘附的最适p H值不同,肠道粘液、体表粘液和鳃粘液粘附力最强的p H值分别为5.0,7.0和8.0。     

76味中草药对无乳链球菌体外抑菌作用

为筛选出对罗非鱼无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)体外抑菌效果较好的中草药,采用平板打孔法测定苏木、黄柏等76味中草药对无乳链球菌的体外抑菌效果,并用试管二倍稀释法测定抑菌效果好的中草药对无乳链球菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC).结果 表明:罗非鱼无乳链球菌对苏木、黄柏、乌...     

副猪嗜血杆菌实时荧光PCR快速检测方法的建立和应用

[目的]建立一种快速准确定量检测副猪嗜血杆菌（HPS）的检测方法。[方法]根据GenBank公布的副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因序列,选择其保守区域设计1对特异性引物。通过优化引物浓度和退火温度,建立快速定量检测副猪嗜血杆菌的实时荧光PCR方法,并评价了其特异性和稳定性。[结果]建立的实时荧光PCR方法最低检测限是50拷贝/μl,重复性好,变异系数均小于2%。该方法特异性强,只能检测副猪嗜血杆菌,不能检测到猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α和猪伤寒沙门氏菌。采用该方法对10份临床疑似HPS感染样本进行检测,其结果与细菌分离培养和常规PCR的结果一致。[结论]建立的实时荧光PCR方法快速、灵敏、特异、重复性高,可用于HPS感染的临床快速检测。     

副猪嗜血杆菌的分离与鉴定及其16S rRNA 生物信息学分析

从湖南省内送检的疑似患多发性浆膜炎与关节炎的猪病料中分离到12株细菌,细菌学试验证明12株细菌均符合副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)形态、培养和生化特性.根据HPS 16S rRNA序列设计引物对12株细菌进行PCR扩增,均得到预期目的条带,将扩增片段测序并运用DNAStar软件与GenBank中不同血清型HPS基因序列进行比对,表明其与Genbank中已公布的不同血清型HPS菌株16S rRNA序列的同源性为90.4%~99.9%,其中与血清5型同源性最高,对所测序列与参考序列进行遗传进化树分析,结果表明其中11株属于血清5型HPS.     

气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立

针对GenBank中登录的气单胞菌属(Aeromonas)的毒力基因甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(GCA T)和嗜水气单胞菌(Aeromonash ydrophila)的16S rRNA基因的保守区设计2对特异性引物.通过进行双重PCR反应体系优化,PCR产物的测序鉴定和特异性试验,建立了一种能同时检测气单胞菌(Aer...     

鳗肺炎克雷伯菌的分离与鉴定

从6尾患肠道胀气的病鳗腹水和肝脏病灶中分离、筛选出一株致病菌EP4,通过细菌形态学、生理生化测定及ATB Expression半自动细菌鉴定仪鉴定均符合肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)特性.以细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,得到EP4的部分16S rRNA基因序列,长约1 502 bp.将所测序列与GenBank中序列进行BLAST比对并构建系统进化树,结果表明其与肺炎克雷伯氏菌[DQ444287]的同源性最高(98.9%).人工感染证明该菌株具有较强的致病力(致死率达70%),30种药物筛选结果显示,EP4对菌必治(头孢三嗪)、先锋V、头孢克洛、氧氟沙星、氟罗沙星、依诺沙星、萘啶酸等高度敏感,而对苯唑青霉素、氨苄青霉素、青霉素G、阿莫西林等不敏感.     

拮抗杉木致害菌Fusarium oxysporum海洋细菌3728的生物学特征及其鉴定

从南海红树林木榄(Bruguiera gymnorrhizo)根际土壤中分离到一株具有拮抗杉木致害菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型SF2(Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum)活性的海洋细菌3728菌株,对分离菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列进行了系统的研究。发现细菌3728与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)序列相似性最高,达到100%,在系统进化树中与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis AJ276351)处于同一分支上,结合形态和生理生化分析结果,将其鉴定为枯草芽孢杆菌。     

三疣梭子蟹牛奶病病原的分离鉴定

从浙江舟山市养殖场患“牛奶病”的三疣梭子蟹(Portunus tritubercularus)乳化的螯足、步足及肝胰脏中分离到1株细菌A1,对其进行了形态特征、生理生化测定和16S rRNA基因序列比较鉴定,并对其药物敏感性进行了检测。结果表明,分离菌株A1为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),其对丁胺卡那霉素、氟苯尼考、盐酸蒽诺沙星、甲磺酸培氟沙星、盐酸左氧氟沙星、庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星、诺氟沙星、新霉素、氧氟沙星等高度敏感,对青霉素钠、头孢曲松、酒石酸吉他霉素、头孢氨苄、四环素、麦迪霉素、土霉素等中度敏感,而对磺胺喹噁啉钠、复方新诺明、磺胺二甲嘧啶钠、磺胺嘧啶等不敏感。     

长白山天池水可培养细菌的16S rRNA鉴定

为了解长白山天池水中细菌的种类及多样性,用NA、1/10NA、R2A、1/10R2A培养基从长白山天池水样品中分离出25株细菌菌株,对其进行16S rRNA基因序列的系统发育分析及形态观察,结果得到9种具有代表性的菌株,9株细菌在系统发育上与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)及厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus sp.)关系密切,其中芽孢杆菌属为分离获得的优势菌属.     

奶牛子宫内膜炎致病菌的16S rRNA序列鉴定

【目的】对奶牛产后子宫内膜炎致病菌进行16S rRNA序列鉴定。【方法】从产后子宫内膜炎患牛子宫分泌物中分离致病菌,通过细菌培养、纯化、分离、革兰氏染色和生化试验进行初步鉴定。选取代表性菌株11株,利用细菌通用引物,通过PCR方法,对其16S rRNA基因的核苷酸序列进行扩增,将扩增产物与pMD19-T载体连接构建克隆载体,经PCR和双酶切鉴定正确后测序,测序结果与GenBank中已注册菌株的16S rRNA基因序列进行比对。【结果】共分离到致病菌株60株,有代表性的11株细菌归类为:SD01为琼氏不动杆菌,SD02为粪肠球菌,SD03为金黄色葡萄球菌,SD04为中间葡萄球菌,SD05为溶血葡萄球菌,SD06为鲁菲不动杆菌,SD07为无乳链球菌,SD08为芽孢杆菌,SD09为枯草芽孢杆菌,SD10为大肠杆菌,SD11为假单胞杆菌。【结论】通过国际公认的16S rRNA序列鉴定技术,准确鉴定出引起奶牛子宫内膜炎的致病菌种类,为临床治疗该病提供了理论依据。     

缢蛏六群体16S rRNA基因片段序列的差异分析

采用PCR技术扩增了缢蛏线粒体DNA的16SrRNA基因片段,PCR产物经纯化、测序、同源序列比对获得长度为440bp的核苷酸序列。利用16SrRNA基因片段分析了江浙沪地区三个野生群体（江苏射阳、上海崇明、浙江象山）和三个养殖群体（江苏射阳、上海奉贤、浙江象山）的遗传多样性,共检测到了19个单倍型和41个核苷酸多态位点。序列分析结果显示,三个野生群体之间出现了明显的遗传分化,其中崇明群体遗传多样性最高,其次为射阳群体,象山群体遗传多样性最低,表明崇明群体未受到养殖群体基因的污染。在养殖群体之间则没有达到遗传分化,且单倍型混杂,聚类结果显示与象山野生群体亲缘关系最近,这表明长期的养殖过程在一定程度上对野生群体产生了影响,降低了种质资源的丰富度。