二斑叶螨内参基因的筛选及解毒酶基因的表达水平

【目的】筛选二斑叶螨（Tetranychus urticae）敏感（SS）和抗甲氰菊酯品系（Fe-R）中合适的内参基因,并通过基因相对表达定量PCR研究二斑叶螨抗性品系解毒酶基因表达水平的变化。【方法】采用实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR,RT-qPCR）技术,分析二斑叶螨5.8S rRNA、α-tubulin、β-actin、ELF、GAPDH、RPL13a、SDHA和TBP共8个候选内参基因mRNA表达水平的稳定性,并分析二斑叶螨酯酶（Carboxyl/cholinesterases,CCEs）、谷胱甘肽转移酶（Glutathione s-transferase,GSTs）及细胞色素P450单加氧酶（Cytocheome P450 monooxygenases,P450s）等主要解毒酶基因相对表达量。用GeNorm和NormFinder软件进行内参基因稳定性评估,通过比较Ct值的方法进行基因相对表达量计算。【结果】8个内参基因中稳定性最高的为α-tubulin;以α-tubulin为内参基因,二斑叶螨Fe-R品系GSTs 基因TuGSTo1、TuGSTd1及P450s 基因CYP3D2相对表达量均显著高于SS品系,而CCEs 基因TuCCE1的表达量有所降低。【结论】在二斑叶螨SS和Fe-R品系中α-tubulin为理想的内参基因,RT-qPCR研究表明TuGSTo1、TuGSTd1和CYP3D2相对表达量的升高可能是二斑叶螨对甲氰菊酯产生高抗性的分子机理。     

过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白（ehanced green fluorescent protein,eGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTM LTX转染山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1 的开放阅读框（ORF）两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418（400 μg•mL-1）筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。     

成肌细胞成脂过程中PPARγ、C/EBPα和Myogenin 基因启动子的甲基化变化

【目的】利用C2C12成肌细胞探讨肌源性干细胞成脂过程与调控成脂和成肌分化的关键转录因子PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）、C/EBPα（CCAAT/enhancer binding protein alpha）和Myogenin启动子区甲基化的关系。【方法】分别用2%马血清和三联诱导剂诱导C2C12细胞成肌和成脂分化,在马血清促进的成肌分化第0、1、3和5天收集细胞进行姬姆萨染色观察肌管形成情况;在三联诱导的成脂分化第0、2、4、6和10天收集细胞进行油红O染色观察脂滴形成情况;提取成肌诱导第0、1、3、5天和成脂诱导第0、2、4、6天的RNA和DNA,分别采用qRT-PCR检测成肌和成脂分化相关基因的表达,采用重亚硫酸盐测序的方法检测PPARγ、C/EBPα和Myogenin启动子区甲基化的变化,并分析基因表达与甲基化状态的相关关系。【结果】①C2C12细胞经马血清诱导形成了多核肌管,表达成肌相关基因,但不表达脂肪特异性基因;三联诱导使C2C12细胞自主分化的肌管中沉积了脂滴,同时表达成脂和成肌相关基因;②重亚硫酸盐测序结果表明,在未分化的成肌细胞中,PPARγ基因启动子的甲基化水平是61%,在三联诱导第2、4和6天,其甲基化程度依次为49%、39%和42%,呈逐渐去甲基化趋势,与PPARγ基因转录负相关;在马血清诱导第3和5天,甲基化水平为56%和48%,与未分化的成肌细胞相比差异不显著,同时PPARγ基因的表达水平也没有显著变化;③Myogenin基因在马血清促进的成肌过程中甲基化水平不断降低（49%、42%、35%和34%）,转录水平急剧增加;在三联诱导过程中,Myogenin启动子的甲基化水平由0天的49%下降为第1天的37%、第3天的41%和第5天的38%,但下降幅度弱于马血清诱导的成肌过程,这一结果与降低的Myogenin转录上调相吻合;④C/EBPα基因在未分化的C2C12细胞中呈低甲基化状态,甲基化程度仅为1.6%,在成肌分化和脂肪沉积过程中均未发生显著变化,与基因表达无显著关联。【结论】成脂和成肌关键转录因子PPARγ和Myogenin启动子区的DNA甲基化变化参与了成肌细胞的分化和脂肪沉积的调控。     

干扰ACACA基因对猪原代肌卫星细胞增殖和成脂转分化过程的影响

【目的】探究乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl-CoA carboxylase α,ACACA)对猪原代肌肉卫星细胞（muscle satellite cells,MSCs）增殖凋亡以及成脂转分化的影响。【方法】通过体外培养MSCs模拟猪肌内脂肪的形成过程，根据ACACA基因序列构建3条小干扰RNA，采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)筛选出干扰效率最高的siRNA进行转染。成功干扰MSCs内ACACA的表达后，分别通过q RT-PCR、CCK-8细胞增殖实验、流式细胞术、油红O染色和检测甘油三酯（TG）等方法对MSCs增殖、凋亡以及转分化时期脂滴形成效果进行评估。【结果】在增殖期干扰ACACA,MSCs内细胞周期标志基因Cyclin D1(P<0.05)、Cyclin E(P<0.000 1)以及抗凋亡基因BCL-2(P<0.05)的表达量下调，促凋亡基因BAX(P<0.05)的表达量上调；在对MSCs进行成脂转分化诱导作用下，MSCs具有向脂肪细胞转分化的能力，而干扰ACACA后，MSCs中脂滴极显著减少（P<0.000 1）。【结论】干扰ACAC...     

鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定

【目的】建立鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定方法.【方法】用I型胶原酶消化法分离天露黄鸡脂肪间充质干细胞(AMSCs),CCK-8检测细胞生长活力,RT-PCR鉴定其特异性标记物,化学法对其进行成脂和成骨分化诱导.【结果和结论】原代及传代的细胞呈成纤维细胞样形态,并能传代至10代,其活力无明显变化;细胞生长曲线呈S型;RT-PCR检测显示AMSCs的特异性标志物CD71、CD44和CD29表达呈阳性,而属于造血干细胞的特异性标志物CD34和CD45呈阴性;AMSCs通过不同诱导液被成功诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,在成脂分化过程中有脂滴形成,油红O染色呈阳性,过氧化物酶体增殖物激活受体基因γ(PPARγ)和脂肪酸基因(FAS)的mRNA表达量升高;在成骨分化过程中有钙结节形成,茜素红染色呈阳性,碱性磷酸酶(ALP)活性检测对照组与诱导组比较差异显著(P﹤0.05),ALP基因和骨形态发生蛋白基因(BMP2)的mRNA表达量升高.研究表明,鸡AMSCs具有分化为多种细胞的潜能.     

湖羊TGF-β1基因特征、表达及其与排卵数的相关性分析

【目的】获取湖羊TGF-β1基因序列,了解TGF-β1序列特征和组织表达特征,分析卵巢组织中TGF-β1基因表达水平与排卵数之间的关系。【方法】通过PCR扩增和测序获得湖羊TGF-β1基因序列,并采用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-PCR分析湖羊TGF-β1基因的组织表达特征;采用Real-time qPCR方法分析多羔组与单羔组湖羊卵巢组织TGF-β1基因表达水平的差异,及其与排卵数之间的关系。【结果】湖羊TGF-β1基因编码区序列全长1 173 bp,编码蛋白含有390个氨基酸残基,包含典型的TGF-β前肽和TGF-β like等结构域。TGF-β1基因在湖羊卵巢组织中高表达,多羔组卵巢组织中TGF-β1基因表达水平显著高于单羔组（P＜0.05）,且表达水平与排卵数呈极显著正相关（P＜0.01）。【结论】多羔组湖羊卵巢组织TGF-β1基因表达水平显著高于单羔组,且与排卵数间呈极显著正相关,推测TGF-β1基因在湖羊卵泡发育、成熟或排卵过程中发挥重要作用,是影响湖羊高繁殖力的候选基因。     

家蚕整合素基因Bmintegrin αPS3的鉴定及亚细胞定位

【目的】克隆家蚕整合素基因Bmintegrin αPS3,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征,并进行原核表达及蛋白纯化,为进一步探究Bmintegrin αPS3在家蚕中的功能奠定基础。【方法】利用RACE方法克隆获得Bmintegrin αPS3的cDNA全长序列;采用RT-PCR方法检测Bmintegrin αPS3的时空表达;在原核表达系统中表达获得Bmintegrin αPS3重组蛋白;并构建Bmintegrin αPS3真核表达载体,转染家蚕胚胎细胞系分析其蛋白亚细胞定位。【结果】家蚕整合素基因Bmintegrin αPS3 编码框全长为2 895 bp,编码965个氨基酸,含有整合素家族蛋白典型的integrin alpha结构域,预测其为跨膜蛋白。构建了Bmintegrin αPS3的原核表达系统,并利用亲和层析纯化获得高纯度的Bmintegrin αPS3原核表达蛋白,为进一步制备抗体获得足够的抗原。在家蚕细胞系中外源表达Bmintegrin αPS3蛋白,显示其主要定位于细胞质和细胞膜中。另外,RT-PCR结果显示Bmintegrin αPS3 mRNA 在血细胞中为特异持续表达。【结论】获得了Bmintegrin αPS3的完整cDNA序列及表达特征,经原核表达、纯化获得其融合蛋白,在细胞水平上初步分析了其亚细胞定位情况。     

小鼠MSCs体外定向诱导分化神经及脂肪细胞的研究

 【目的】建立昆明小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养体系,并鉴定其定向诱导分化为神经及脂肪细胞的能力。【方法】采用贴壁培养法分离培养昆明小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过相差倒置显微镜对其进行形态学特征观察;通过碱性磷酸酶（AKP）染色、Hoechst 33258染色、瑞士-姬姆萨复合染色检测MSCs的表型特征;通过β-ME诱导MSCs定向分化为神经样细胞,诱导后的细胞进行H.E染色,观察其形态学特性;通过NF-200、NSE免疫荧光细胞化学方法对已分化的神经样细胞进行鉴定和分化率分析;通过马血清诱导MSCs定向分化为脂肪细胞,观察其体外生长过程,并对诱导后的脂肪细胞进行油红O染色鉴定和分化率分析。【结果】分离得到的MSCs为成纤维样细胞,可见多个核仁,AKP染色阳性率为93.2%±1.5%;β-ME诱导后,MSCs分化为多种表型的神经细胞与原代培养的小鼠全脑细胞的外形相似,诱导后的神经细胞NF-200、NSE免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,NF-200阳性率为85.4%±1.8%,NSE阳性率为82.7%±2.1 %;马血清诱导后,MSCs可100%分化为脂肪细胞,油红O染色为阳性。【结论】 采用贴壁培养法能够成功分离和培养昆明小鼠的MSCs,分离得到的MSCs具有定向分化成多种神经细胞和脂肪细胞的能力。     

猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37 ℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈“S”型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点（P<0.01）;CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著（P<0.01）。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。     

氟对体外培养成骨细胞骨钙素基因表达的调控

 【目的】探讨氟对成骨细胞骨钙素(OCN)基因表达的影响。【方法】应用酶消化法分离初生小鼠头盖骨成骨细胞,取第3代成骨细胞,加入不同浓度（0～10-3mol?L-1）氟化钠,提取细胞总RNA,通过实时荧光定量PCR方法,观察成骨细胞OCN基因表达的变化。【结果】各浓度NaF均能刺激体外培养成骨细胞OCN基因的表达呈剂量依赖关系,当浓度为5×10-4mol?L-1时OCN基因表达量的增加最为明显,约为对照组的30倍。【结论】各浓度的NaF均能在基因水平刺激OCN的表达,OCN在氟中毒所致的骨相损害中起着重要的作用。     

Activin A特异性对人胚胎干细胞向限定性内胚层诱导分化的促进作用

【目的】研究Activin A对人胚胎干细胞（hESCs）向限定性内胚层（DE）诱导分化的促进作用及其信号通路分子,为hESCs向DE诱导分化体系的优化提供参考。【方法】在人饲养层体系培养的hESCs中,收集100 ng/mL Activin A分别诱导0,6,12,24,48,72,96,120 h的细胞,用实时荧光定量RT-PCR检测原条标记Gsc和Mixl1、中内胚层共同前体标记Brachyury、内胚层标记Foxa2和Sox17、中胚层标记Flk1、外胚层基因Pax6、多能性相关基因Oct4与Nanog表达水平的变化,用细胞免疫荧光检测Brachyury和Sox17蛋白表达水平的变化。【结果】在人饲养层（HEF）培养体系上,高浓度Activin A能更快地促进中内胚层基因的表达并提高其表达水平;Brachyury和Sox17蛋白的细胞免疫荧光检测表明,Activin A诱导12和48 h就可检测二者的表达明显增加,且二者的表达水平分别在诱导48和96 h时达到高峰;hESCs高效分化为限定性内胚层细胞,DE细胞分化率为（81.7±5.4）%,并且体外的内胚层分化过程遵循从原条开始、经过中内胚层共同前体阶段、再到内胚层的发育过程,与体内发育规律相似。【结论】Activin A能特异性地诱导人胚胎干细胞向限定性内胚层分化,转录调控Brachyury和Sox17蛋白的表达。     

牛fabp3和fabp4基因真核表达载体的构建 及在小鼠成肌细胞中的表达

【目的】分别构建牛fabp3和fabp4基因真核表达载体,并观察载体转染小鼠成肌细胞后基因的表达以及对内源fabp3和fabp4基因表达的影响,检测肉质性状形成相关基因在转基因细胞中的表达及对内源功能基因的影响。【方法】 以pDsRED质粒为骨架载体,分别将人肌红蛋白启动子与目的基因相连、CMV启动子与红色荧光蛋白报告基因相连构建肌肉特异性表达fabp3基因的载体pDsHF3和表达fabp4基因的载体pDsHF4;用脂质体瞬时转染小鼠成肌细胞,72 h后用2%孕马血清诱导成肌细胞向肌管的分化;利用real-time PCR技术检测转染前后成肌细胞中外源牛fabp3和fabp4基因和内源小鼠fabp3和fabp4基因的表达量。【结果】与对照组相比,小鼠成肌细胞分别转染pDsHF3和pDsHF4表达载体,24 h后外源牛fabp3和fabp4基因均获得高水平的表达,48 h后有所回落;而内源小鼠fabp3和fabp4基因在成肌细胞和诱导分化的肌管细胞中的表达均受到不同程度的影响。【结论】构建的真核表达载体能在成肌细胞中高效表达,外源牛fabp3或fabp4基因的转入能够影响小鼠成肌细胞及肌管中内源fabp3和fabp4基因的表达。     

绵羊MSTN基因慢病毒表达载体的构建及其对成肌细胞的分化作用

【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】 克隆的新疆细毛羊MSTN基因编码区全长序列（1 128 bp）与NCBI上公布的序列99.9%同源,仅在外显子2上存在单碱基突变;Western blotting检测结果显示,MSTN过表达成肌细胞过表达MSTN蛋白;免疫荧光检测表明,MSTN过表达成肌细胞的肌管融合率与肌管直径分别为5.69%和12.35 μm,显著低于非转化成肌细胞（10.21%和18.5 μm）（P<0.05）;Realtime RT-PCR结果显示,MSTN过表达成肌细胞中的Myogenin、p21、MyoD-基因表达显著下调,Smad3基因表达极显著上调（P<0.01）。【结论】 成功构建了细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,MSTN基因对细毛羊成肌细胞的分化具有显著的抑制作用,确定了MSTN基因与Myogenin、p21、MyoD及Smad3基因在成肌细胞分化过程中的调控关系。     

猪肌肉干细胞在三维水凝胶中的分化研究

【目的】 探究猪肌肉干细胞在三维水凝胶中的分化效果,为体外诱导肌肉干细胞分化成为肌肉组织提供方法指导。【方法】 将一定数目的猪肌肉干细胞分别在二维和三维条件下诱导分化（二维条件指在培养皿中培养细胞,三维条件指在水凝胶中培养细胞）,分别收取增殖阶段、预分化阶段、分化初期、分化成熟、分化末期的二维培养细胞的RNA和蛋白样品,以及分化7和14 d的三维培养细胞的RNA和蛋白样品。利用RT-qPCR技术检测细胞在两种条件下分化至不同阶段时成肌相关基因MYOG、CAV-3、MyHC-slow、MyHC-2a的表达水平;利用Western Blot技术检测细胞在两种条件下分化至不同阶段时MYOG、MyHC蛋白的表达水平;利用免疫荧光染色技术观察猪肌肉干细胞在二维和三维条件下融合形成的肌管;使用氨基酸自动分析仪检测分化14 d培养肌肉组织的氨基酸含量及组成。【结果】 二维培养的猪肌肉干细胞在分化第3天时开始发生肌融合,在分化第7天形成成熟肌管,随后进入分化末期,肌管开始脱落。三维培养的猪肌肉干细胞在分化第7天时还未完全伸展,细胞的MYOG和CAV-3表达水平低;分化第14天时水凝胶内已形成多核肌管,MYOG和CAV-3表达达到二维分化水平。三维分化有利于终末分化基因MyHC-slow和MyHC-2a的表达,分化14 d时MyHC-slow的表达量是二维分化7 d的12倍,MyHC-2a的表达量是二维分化7 d的4倍,但是MyHC蛋白的表达量仅为二维分化7 d时的1/6。氨基酸分析结果表明体外培养肌肉组织中17种水解氨基酸含量均低于猪肉,且必需氨基酸在总氨基酸的占比也低于猪肉,但是呈味氨基酸的占比相较猪肉更高。【结论】 猪肌肉干细胞可以在三维胶原水凝胶中分化形成肌管,且三维条件有利于成肌分化相关基因表达,但要实现MyHC蛋白的高表达还需进一步研究,按此方法体外培养的肌肉组织有较高的呈味氨基酸含量,可能会有较好的风味。     

Smads与Hippo通道中YAP1基因在湖羊肌肉组织中时空表达研究及关联分析

【目的】通过在mRNA表达水平检测TGF-β/smad信号通路基因在湖羊肌肉组织中时空表达,来探究各基因的表达规律及内在联系。【方法】利用荧光定量PCR技术对湖羊Smads基因在出生后不同生长阶段（2日龄,2月龄和6月龄）不同性别的两种不同骨骼肌（腓肠肌、趾长伸肌）的相对表达进行分析,以及对湖羊Smad家族（Smad2、Smad3、Smad4、Smad7）基因、YAP1基因的表达相关性分析。【结果】湖羊肌肉TGF-β/smad信号通路中Smads基因时空表达规律研究发现：Smads在不同肌肉组织的表达分析中,Smads在腓肠肌中的表达高于趾长伸肌,可能与这两种骨骼肌分属不同部位有关;Smads在不同月龄的表达分析中,Smad2、Smad3、Smad4在2日龄的表达量均高于其它月龄,而Smad7在2日龄的表达量低于6月龄,2月龄时表达量最低;在不同性别的表达分析中,Smads在2日龄公羊中的表达量高于母羊,Smad2、Smad4、Smad7在2月龄和6月龄则低于母羊;Smad3在不同生长阶段中公羊表达量高于母羊。湖羊肌肉TGF-β/smad信号通路中Smads、YAP1基因表达相关性研究发现：在2日龄腓肠肌中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在2月龄腓肠肌中,Smad2的表达与YAP1存在显著正相关（P＜0.05）,Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在6月龄腓肠肌中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在腓肠肌的不同生长阶段中,Smad3的表达YAP1存在极显著负相关（P＜0.01）,Smad2、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）。在2日龄趾长伸肌中,Smad3的表达与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01）,Smad2、Smad4、Smad7的表达与YAP1存在显著正相关（P＜0.05）;在2月龄趾长伸肌中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在6月龄趾长伸肌中, Smad7与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01）;Smad2、Smad3、Smad4的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）;在趾长伸肌的不同生长阶段中,Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01）。【结论】由此推断不同组织、生长阶段以及性别等因素均可影响Smads在肌肉中的表达;在湖羊这两种不同肌肉组织中,Hippo通道中YAP1基因可通过参与调控TGF-β/smad信号通路而参与肌肉的增殖和分化过程。     

TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制

【目的】卵泡抑素（Follistatin）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积,可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组 Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞,阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料,采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞长到70%-80%时,将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·mL^-1的Follistatin培养基,继续培养36 h后,采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况;使用抗pax7抗体染色,DAPI染核,鉴定骨骼肌卫星细胞;采用real-time qPCR方法检测Follistatin对骨骼肌卫星细胞增殖过程中的标记基因PCNA、生肌因子基因MyoD和TGF-β信号通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表达的影响。【结果】在倒置显微镜下观察,传代培养12 h鸭骨骼肌细胞一部分未贴壁呈圆形,一部分贴壁呈梭形。24 h后细胞全部贴壁,细胞略有变长。2 d后细胞继续增多,且呈长梭形。3 d后细胞数目增加,个别细胞融合。4 d后细胞数目进一步增加,细胞变粗,个别细胞融合。5 d后有少量细胞开始分化,细胞进一步融合。Pax7免疫荧光染色分析显示,95%以上的细胞中Pax7呈阳性表达;CCK-8检测细胞增殖分析表明,不同浓度的Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞后,各处理组细胞增殖均显著高于对照组(P＜0.01),且10 ng·mL^-1 Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞增殖效果最明显,为最佳处理浓度;与对照组相比,10 ng·mL^-1 Follistatin处理组的MyoD基因表达量显著下降(P＜0.05),PCNA基因表达量显著升高(P＜0.05),Myf5基因表达量显著升高,TGF-β和Smad2基因表达显著升高(P＜0.05),且Smad3基因表达量极限著升高(P＜0.01);Western blotting检测蛋白表达水平结果表明,与对照组相比,TGF-β、Smad2 和Smad3磷酸化水平也显著升高。【结论】10 ng·mL^-1 Follistatin能显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,这一过程可通过TGF-β/Smad信号通路实现。使用最佳Follistatin处理浓度能够显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,该研究为鸭骨骼肌生长发育调控机理研究奠定分子基础。     

脂代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控机制

【目的】探索家鸡雄性生殖细胞分化过程中脂代谢相关基因以及信号通路的调控机制,以期为完善体外诱导体系提供依据。【方法】采用流式细胞分选法获得纯度较高的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、原始生殖细胞(primitive germ cells,PGC)和精原干细胞 (spermatogonial stem cell,SSC),提取细胞总RNA。利用RNA-seq高通量分析方法对这三种细胞进行转录组水平测序,进行GO（Gene ontology）分析和KEGG通路富集,寻找脂代谢相关基因以及信号通路;并利用脂代谢--视黄醇代谢通路终产物视黄酸（retinoic acid,RA）以及抑制剂苯磺酰异羟肟酸 (piloty’s acid)在体外诱导ESC向雄性生殖细胞分化和体外鸡胚注射后孵化,qRT-PCR（quantitative real time PCR）检测视黄醇代谢通路上差异基因的表达变化,与RNA-seq结果进行比较分析同时检测雄性生殖细胞标记基因的变化情况。【结果】GO功能显著性富集和 Pathway 显著性富集分析结果发现：在ESC向SSC分化过程中共存在328个基因持续参与脂代谢调控,富集到27条脂代谢通路中,包括视黄醇代谢、初级胆汁酸的合成、甾类激素的生物合成、脂肪酸代谢、甘油酯代谢以及类固醇的生物合成等通路。在视黄醇代谢通路中ADH5在PGC中特异表达,ALDH1A1在整个发育过程中持续上调,ADH5和ALDH1A1在细胞中参与视黄酸的合成;CYP26b1在整个发育过程中持续上调,参与视黄酸的降解过程;RA体外诱导ESC向SSC方向诱导试验结果表明ADH5、ALDH1A1和CYP26b1家族基因在体外RA诱导过程中变化与体内分化过程一致,RA诱导组产生的SSC样细胞显著高于控制组和Piloty’s Acid+RA组。鸡胚注射抑制剂试验结果表明视黄醇通路被抑制后孵化至18d后SSC细胞表面特异标记基因integrinα6和integrinβ1的表达水平显著的低于正常的孵化组(CON)和阴性对照组（BLANK）【结论】脂代谢--视黄醇代谢通路在家鸡雄性生殖细胞的分化过程中起重要作用,体外利用视黄醇代谢通路终产物RA进行诱导时第2天出现类胚体,第4、6天类胚体逐渐增大,第8天开始裂解,在第10天出现SSC样细胞,而在诱导过程中抑制视黄醇通路信号后则会降低SSC样细胞的产生,而在体外孵化过程中视黄醇通路抑制后也能影响SSC细胞的产生。