3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞（PK15）的转染效率，为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象，用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况，采用CCK-8检测细胞存活率，进而比较3种方法的转染效果。结果显示，转染PK15细胞后，电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体（P<0.01），但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著（P>0.05）；EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好，脂质体方法较差，与细胞转染效率基本一致；CCK-8结果显示，电穿孔转染后细胞存活率最低，极显著低于对照组（P<0.01），脂质体方法显著低于对照组（P<0.05），慢病毒方法与对照组间差异不显著（P>0.05）。综合考虑转染效率及细胞活性，本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞，为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。     

转基因猪中抗生素标记基因neo漂移风险评估

本试验旨在研究转基因猪中抗生素标记基因neo漂移的可能性。利用Southern blotting鉴定F1代仔猪的显隐性,结果发现6头仔猪中有3头为转基因仔猪,3头为阴性仔猪。通过PCR技术对试验仔猪血液和消化道组织中neo基因进行检测,结果发现neo基因没有在血液水平和消化道组织中发生漂移。通过PCR技术对试验仔猪肠道细菌中neo基因进行检测,在肠道细菌基因组中没有检测到neo基因的存在。检测结果表明,仔猪血液、肠道细菌和消化道组织等都没有发生neo基因的漂移。     

猪C1QTNF3基因可变剪接体的鉴定及介导miR-101调控成脂分化的研究

旨在研究猪C1QTNF3基因可变剪接体的特性及miR-101通过C1QTNF3基因促进猪脂肪SV细胞成脂分化的机制。本研究采集3头30日龄健康马身猪仔公猪心、肝、脾、肺、肾、胃、股二头肌、腰大肌、皮下脂肪和背部脂肪组织样品,首先利用RT-PCR技术和生物信息学方法对C1QTNF3基因的不同转录本进行扩增和生物学特性分析,采用qRT-PCR技术检测C1QTNF3基因不同转录本在猪组织中的表达变化。随后,利用生物信息学预测发现,C1QTNF3上游的调控因子是miR-101,采用双荧光素酶报告试验验证miR-101对C1QTNF3的调控作用。最后,利用油红O染色和qRT-PCR技术检测过表达miR-101对猪脂肪SV细胞成脂分化的影响。基因克隆得到猪C1QTNF3存在两个转录本C1QTNF3和C1QTNF3-1,其中C1QTNF3-1为新鉴定的转录本;测序分析显示,与C1QTNF3相比,C1QTNF3-1的第1外显子区域缺失了219个碱基,少编码73个氨基酸。进化树分析显示,猪C1QTNF3和C1QTNF3-1蛋白序列与人和马来亚穿山甲等物种的亲缘关系较近。C1QTNF3和C1QTNF3-1在猪各组织中均有表达,且在各组织中C1QTNF3-1的表达量均极显著高于C1QTNF3（P<0.01）。过表达miR-101极显著下调C1QTNF3 3'UTR区域的荧光素酶活性（P<0.01）和C1QTNF3 mRNA的表达（P<0.01）,同时增加了脂肪细胞成脂分化关键基因PPARγ、C/EBPβ、SREBP-1c和FABP4的mRNA表达量（P<0.01）。本试验成功克隆了猪C1QTNF3基因的两个可变剪接体,其中C1QTNF3-1在猪不同组织中均高表达,推测该转录本为基因发挥功能的主要亚型。并深入研究了C1QTNF3基因的上游调控因子,揭示了miR-101靶向C1QTNF3促进成脂分化的机制,丰富了C1QTNF3的生物学作用和调控网络。     

猪FNDC5基因生物信息学分析及表达研究

本试验旨在扩增抗纤维连接蛋白Ⅲ型结构域蛋白5(Fibronectin Type Ⅲ Domain Containing Protein 5,FNDC 5)基因的编码序列(Coding Sequence,CDS),通过生物信息学软件分析FNDC5的特性,并分析该基因在晋汾白猪不同组织中的表达情况。选取1日龄晋汾白猪,以背最长肌cDNA为模板克隆FDNC5基因的CDS序列,利用生物信息学方法分析FNDC5的结构和功能,采用qRT-PCR检测FDNC5基因在晋汾白猪不同组织中的表达水平。结果表明,猪FDNC5基因的CDS序列有843bp,共编码280个氨基酸。生物信息学预测,FNDC5为亲水性蛋白,二级结构中α螺旋、β转角、延伸链和无规则卷曲分别占31.79%、4.64%、20.36%和43.21%。qRT-PCR结果显示,FDNC5基因在肌肉、肝脏和心脏中高表达,在其他组织中的表达量较少。本研究结果为进一步探讨猪FDNC5基因的功能提供了参考依据。     

基于RNA-Seq技术筛选影响猪肌纤维性状的候选基因

旨在探究影响肌纤维性状的候选基因和信号通路。本研究以马身猪和大白猪为研究对象,采用HE染色法分析6月龄马身猪和大白猪背最长肌肌纤维直径和密度,利用RNA-Seq分析马身猪和大白猪背最长肌组织中基因表达情况,并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,再通过qRT-PCR验证RNA-Seq结果的准确性。结果显示,马身猪背最长肌肌纤维直径极显著低于大白猪(P<0.01),而肌纤维密度极显著高于大白猪(P<0.01)。转录组测序结果显示,在6月龄马身猪和大白猪背最长肌中,差异倍数在2倍以上的基因共105个,其中,马身猪相对于大白猪上调的基因有55个,下调的基因有50个。GO富集分析表明,差异表达基因主要富集在与线粒体相关的细胞组分和骨骼肌分化有关的生物学过程中;KEGG分析结果显示,这些差异表达基因主要参与到与氧化磷酸化有关的信号途径。qRT-PCR和RNA-Seq对6个DEGs表达情况的检测结果表明它们的表达趋势相同,说明RNA-Seq结果准确可靠。结合差异基因表达丰度、GO和KEGG富集分析结果,本研究发现,MYL3、MYH3、MYH6基因通过影响肌纤维的组成而影响肌纤维特性,ND6基因通过参与线粒体氧化磷酸化过程影响肌纤维类型,MICU2基因通过维持线粒体Ca²⁺浓度的稳态影响细胞功能,编码转录因子的EGR1和FOS基因通过调节细胞增殖、分化和凋亡等过程影响肌肉生长发育。本研究初步揭示了造成马身猪和大白猪肌纤维性状差异的主要原因,为猪肉品质的改善提供了相应的理论依据。     

晋汾白猪ApoA5基因单倍型与体重和肉质性状的相关性分析

试验旨在探究晋汾白猪载脂蛋白A5（apolipoprotein A5,ApoA5）基因的单倍型与体重和肉质性状的相关性。选取180头晋汾白猪为研究群体,利用PCR技术检测ApoA5基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）,并采用Haploview软件分析这些SNP位点的连锁不平衡程度;筛选非完全连锁的SNP位点,构建不同的ApoA5基因单倍型,统计不同单倍型的基因频率,并通过SPSS软件分析不同ApoA5基因单倍型与晋汾白猪体重和肉质性状的相关性,鉴定优良性状的ApoA5基因单倍型。结果显示,晋汾白猪ApoA5基因共检测到21个SNPs位点,其中5个完全连锁单倍型块,分别包含5、2、3、4和2个SNPs位点;另外10个非完全连锁的标签SNP组合成不同的ApoA5基因单倍型,其中Hap 1的基因频率最高,达到46.7%,远高于其他单倍型;ApoA5基因单倍型与晋汾白猪的初生重、断奶重、6月龄体重、肌内脂肪含量、剪切力和滴水损失均具有明显的相关性,而与pH_{24 h}没有明显的相关性;ApoA5基因Hap 11晋汾白猪的初生重、断奶重、6月龄体重和肌内脂肪含量均最高,且剪切力最低,滴水损失也相对较低;Hap 6的初生重最低;Hap 2的断奶重和6月龄体重均最低;Hap 3的肌内脂肪含量最低,剪切力最高;Hap 10的滴水损失最高。晋汾白猪ApoA5基因Hap 11属于优良性状单倍型,是一个具有优良性状的分子标记,可以用于晋汾白猪的分子育种,提高选种效率。     

CREB-H基因在猪不同组织中表达谱及肝脏中的表达规律

本研究旨在分析环腺苷酸应答元件结合蛋白H（cyclic AMP-responsive element-binding protein 3-like 3，CREB-H）在猪不同组织中的表达谱及其在马身猪和大白猪肝脏中的发育性表达规律。采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测1日龄猪12个组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、小脑、下丘脑、背最长肌、股肌和腰肌）中CREB-H基因的表达谱，以及CREB-H在1、30、60、90、120、150和180日龄马身猪和大白猪肝脏中的表达规律。结果显示，CREB-H基因mRNA在马身猪的12个组织中广泛表达，其中在肝脏和小肠中高表达；CREB-H蛋白在肝脏组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05），在心脏、脾脏和小脑中不表达。猪肝脏CREB-H基因mRNA和蛋白的发育表达受日龄、品种、品种与日龄相互作用的影响（P<0.01）。马身猪和大白猪肝脏中CREB-H基因mRNA和蛋白的表达量均在1日龄时达到最大值。在各发育阶段，马身猪CREB-H蛋白的表达量均极显著高于大白猪（P<0.01），且CREB-H主要在猪肝脏中表达。CREB-H在两猪种肝脏中的表达存在时空差异，可能与猪在不同发育期的脂质代谢能力有关，本试验结果为研究猪的脂质代谢调控机制提供一定的理论依据。     

运用SNP芯片评估马身猪保种群体的遗传结构

旨在研究马身猪保种群体的遗传多样性、亲缘关系和家系结构。本研究利用Illumina CAUPorince 50 K SNP芯片检测39头保种马身猪的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）；采用Plink软件计算最小等位基因频率、多态信息含量、观察杂合度和期望杂合度，分析保种群体的遗传多样性；采用Plink软件构建状态同源（identity by state，IBS）距离矩阵和分析连续性纯合片段（runs of homozygosity，ROH），采用Gmatix软件构建G矩阵，分析保种群体的亲缘关系；采用Mega X软件构建群体进化树，分析保种群体的家系结构。结果显示，39头保种马身猪中共检测到43 832个SNPs位点，平均基因型检出率为0.980 1；通过质控的SNPs位点有28 859个，其中72.4%具有多态性，该款SNP芯片适用于分析马身猪的遗传多样性。有效等位基因数为1.563 4，多态信息含量为0.412，最小等位基因频率为0.258，表明马身猪保种群体的遗传多样性比较丰富；平均观察杂合度为0.354 1，平均期望杂合度为0.349 9，说明马身猪保种群体出现了分化；平均IBS遗传距离为0.284 2，其中公猪为0.285 2，IBS距离矩阵和G矩阵结果均表明部分种猪之间存在亲缘关系；ROH共有8 131个，其中46.15%的长度在400～600 Mb之间，平均近交系数为0.237，说明保种群体的近交程度高；群体进化树结果表明，马身猪保种群体来源于3个家系，各家系的个体数量差异明显。马身猪保种群体的遗传多样性较丰富，但近交程度高，家系少，各家系的个体数量差异大，容易引起遗传多样性的丢失，因此，需从原种场引入新的血统，扩大保种群体数量，降低近交系数。     

仔猪肠道微生态及其调控因素研究进展

肠道微生态能够影响机体营养物质的摄入、储存及消耗,对动物生长发育影响较大。微生态的建立受出生方式、饲养模式、抗生素、疾病及周围环境等多种因素的影响。随着相关研究的不断深入,肠道菌群的作用正日益受到重视。宿主的健康生长需要一个动态平衡的肠道微生态环境。仔猪阶段平衡的肠道微生态环境尚未建立,易受外界因素影响,造成生长迟缓、饲料转化率低下甚至疾病的发生。调节肠道菌群被认为是可以减少动物疾病的发生并且提高饲料转化率的一种行之有效的技术手段。作者回顾了国内外关于仔猪肠道微生态的研究进展,从肠道微生态的组成与功能入手,从不同发育阶段仔猪肠道微生态建立的过程及调控手段展开论述,以期为研究仔猪肠道微生态的形成、成熟及微生态对仔猪生长发育的作用提供理论参考。     

基于RNA-seq结果开发猪SSR标记

旨在开发猪SSR标记,为猪遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、标记辅助选择等奠定基础。本研究基于前期对6月龄大白猪和马身猪背最长肌RNA-seq结果,根据SSR在染色体上的分布、碱基类型、重复次数等的差异随机筛选154个位点,设计合成SSR引物,进行PCR扩增、PAGE检测及克隆测序验证,开发多态性SSR标记。利用开发的SSR标记对马身猪、大白猪、晋汾白猪及山西黑猪等4个猪种各30头6月龄个体进行遗传多样性分析,以评价所开发SSR标记的应用效果。结果,从36 693条转录组Unigene序列中搜索到10 488个SSRs位点,纯合型SSR为9 424个,复合型SSR为1 064个,分布于6 953条Unigene序列,其中4 727条Unigene含有单个SSR,2 226条Unigene含有2个及以上SSRs,SSR发生频率为18.95%,出现频率为28.58%。优势SSR重复类型为单、三、二核苷酸重复,其重复次数主要集中于5~22次;优势重复基序序列类型为A/T、AC/GT、GCC/GGC,长度类型为10~20 bp。随机筛选154个位点进行验证,共有124对引物扩增出清晰、特异的条带,扩增效率为80.52%,其中25对SSR引物具有多态性,占比为16.23%。利用25对SSR引物对4个猪种共120个个体进行遗传多样性分析,共识别到131个等位基因,等位基因数为2~7个,平均等位基因数为5.24,平均有效等位基因数为3.487 1,平均PIC为0.646 7,呈高度多态,总体表现出较高的多样性。本研究结果表明,基于猪转录组测序结果开发SSR标记是可行的,结果丰富了猪可用SSR标记数据库,且开发的SSR标记准确可靠,多态性高,可用于猪的遗传多样性分析。