徐淮山羊H-FABP基因克隆、表达产物亚细胞定位的研究及转基因小鼠的制备

旨在克隆徐淮山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的cDNA,探讨其生物信息学功能。通过EGFP融合蛋白对该基因亚细胞水平的表达定位,探究该基因在异种生物体内表达情况,探索制备异种转基因动物的可能性。采用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆徐淮山羊H-FABP基因cDNA,进行生物信息学分析,构建其融合表达载体pEGFP-H-FABP。脂质体(LTX)介导基因转染山羊成纤维细胞(GEF),48h后进行荧光检测,RT-PCR检测mRNA在细胞内的表达。利用睾丸注射将目的基因转入小鼠体内,在DNA和蛋白水平上检测目的基因的表达情况。结果,徐淮山羊H-FABP基因完整编码区(CDS)大小为402bp,编码133个氨基酸,GenBank登录号为AY466498.1。徐淮山羊H-FABP序列与人、鸡、褐家鼠、奶牛、野猪、驴及斑马鱼相应编码区同源性为89%、76%、85%、84%、93%、91%、70%,氨基酸序列同源性为90%、79%、88%、97%、95%、94%、72%。成功构建融合表达载体pEGFP-H-FABP,目的基因在mRNA水平上成功表达。目的蛋白定位于细胞质中,与在线预测结果相同(无信号肽,定位于细胞质中)。通过尾静脉注射和睾丸注射,该基因可以在小鼠体内实现暂态表达和持续性表达。本研究成功克隆了徐淮山羊H-FABP基因cDNA,而且H-FABP基因在进化过程中是保守的。该蛋白无信号肽,在单细胞水平上可表达于细胞质中,在小鼠体内也可以成功表达。     

牛生长激素BGH基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-BGH的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从11月龄的牛脑垂体组织中扩增出BGH基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-BGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,结果表明,成功构建了pEGFP-N1-BGH真核表达载体。     

过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白（ehanced green fluorescent protein,eGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTM LTX转染山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1 的开放阅读框（ORF）两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418（400 μg•mL-1）筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。     

徐淮山羊c-Myc基因启动子的克隆及其功能的初步分析

本研究旨在确定徐淮山羊c-Myc基因启动子区域,找出该基因启动子的核心调控区,初步探讨c-Myc基因的表达调控机制。根据UCSC基因组数据库已公布的绵羊c-Myc基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增c-Myc基因的一系列启动子缺失片段,定向克隆至pEGFP-N1和PGL3-c-Myc,分别转染gFF、COS7及P19细胞,并进行TSA和NFAT1诱导,同时对-402~-249bp区域的转录因子SP1结合位点进行定点突变,最后进行双荧光报告基因活性检测。结果表明,徐淮山羊c-Myc基因5′侧翼区-1 334~+1bp区域的启动子活性最强,-402~+1bp区域为c-Myc基因启动子基本活性区域。进一步研究发现,-1 334~-971bp、-587~-147bp区域存在正调控元件,-1 976~-1 334bp、-971~-587bp区域存在负调控元件。TSA和NFAT1均能增强cMyc启动子的活性,SP1结合位点定点突变后,启动子活性降低。本试验通过构建包含c-Myc基因启动子不同片段的重组报告基因载体并比较其转录活性,确定了c-Myc基因启动子的核心区域,发现转录因子SP1是c-Myc基因启动子核心区域的调控元件,为进一步研究c-Myc基因的表达调控机制奠定了基础。     

花椒提取物对断奶仔猪生产性能和免疫性能的影响

本文旨在研究花椒提取物对断奶仔猪生产性能及免疫性能的影响。选择27日龄、体重平均为7 kg左右的128头杜长大三元杂交猪,按照"公母各半、体重相近"的原则随机分为4组,每组4个重复,每个重复8头猪,对照组饲喂基础日粮,试验1组为基础日粮+0.1%的花椒提取物,试验2组为基础日粮+0.2%的花椒提取物,试验3组为基础日粮+0.3%的花椒提取物,饲喂时间30 d。结果表明:1)在生产性能方面:整个试验期间断奶仔猪平均日增重,各试验组之间差异不显著(P0.05),试验1组,2组,3组的仔猪日增重与对照组相比分别提高了1.38%(P0.05)、3.61%(P0.05)和5.76%(P0.05);各试验组与对照组相比猪的日采食量无显著变化,但随着花椒添加量的增加有升高的趋势;各试验组料重比之间差异均不显著(P0.05),并且与对照组相比各试验组的料重比都有降低的趋势。2)在免疫性能方面:各试验组与对照组相比,血清中IgA的含量无显著差异(P0.05);血清中IgG的含量分别提高了11.76%(P0.05),14.88%(P0.05)和15.57%(P0.05),试验组之间差异并不显著;血清中IgM的水平分别提高了21.74%(P0.05),39.13%(P0.05)和43.38%(P0.05),各试验组之间差异不显著;血清中补体C_3的含量分别提高了18.18%(P0.05),18.18%(P0.05)和27.27%(P0.05);血清中补体C_4含量各组之间均无显著的差异。由此可知:日粮中添加适量的花椒具有促进断奶仔猪的生长,提高断奶仔猪免疫机能的作用,以0.3%的添加量比较适宜。     

贵州安顺龙宫地区蝴蝶种类分布及多样性初步调查

为了解贵州安顺龙宫地区蝴蝶种类分布及多样性,利用网捕法和诱捕网法,在龙宫地区展开了调查,采集到蝴蝶标本424号,隶属11科58属87种。龙宫地区蝴蝶多样性指数为5.9105,物种数量较丰富,均匀度指数为0.9174,优势度指数为0.0495。4种生境类型中,蝴蝶多样性指数为山坡山谷河滩田地,均匀度指数为河滩山坡山谷田地,优势度指数为田地山坡河滩山谷。5个月份中,蝴蝶种类多样性指数为7月5月9月3月11月,均匀度为3月9月5月7月11月,优势度为11月3月9月7月5月。保护龙宫地区的蝴蝶资源,具有一定的生态意义。