奶山羊骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

【目的】分离、培养奶山羊骨髓间质干细胞(MSCs),探讨其生物学特性,为心血管、神经退化,尤其是不育症患者的细胞移植治疗及相关细胞发育分化研究奠定基础。【方法】采用贴壁培养法进行MSCs的分离和培养,通过形态学观察、生长曲线测定、免疫细胞化学染色和RT-PCR技术等进行检测;并采用免疫细胞化学法对自发分化的细胞及定向诱导分化的神经样细胞、心肌样细胞、生殖样细胞进行检测,计算生殖样细胞的阳性率。【结果】分离得到的MSCs为成纤维样细胞,其增殖能力强,无致瘤性,已连续传代至22代;其表达胚胎干细胞(ESCs)的表面标记Oct4、Nanog、C-myc和TERT;MSCs形成类胚体自发分化的细胞表达3胚层特异标志基因AFP、β-ⅢTubulin和心肌α-actin;MSCs经β-巯基乙醇诱导,定向分化为表达Nestin和β-ⅢTubulin的早期神经样细胞,经5-氮胞苷(5-Aza)诱导,可定向分化为表达CT3及心肌α-actin的心肌样细胞,并出现肌管样结构,经维甲酸(RA)诱导,分化的细胞表达生殖细胞减数分裂前期的蛋白Vasa、Scp3和CD49f(α6整合素)等生殖细胞标记,其阳性率分别达到35.7%,24.0%和14.0%。【结论】自奶山羊骨髓分离得到MSCs,其具备间质干细胞的基本特性,并具有向神经细胞、心肌细胞、生殖细胞分化的潜能。     

小鼠EG细胞体外分化为神经细胞的一种简单有效方法

【目的】探讨一种简单有效的小鼠EG(Embryonic germ cells,EG)细胞体外分化为神经细胞的方法。【方法】将昆明小鼠EG细胞在老化饲养层上培养3~4周,使EG细胞在高密度条件下向神经细胞分化,研究不同浓度维甲酸(Retinoic acid,RA)对EG细胞分化的诱导效果。【结果】小鼠EG细胞在高密度培养条件下向神经细胞分化,可获得较高比例的神经细胞样克隆,nestin染色阳性率达62.9%;经检测EG细胞分化产生的神经细胞样克隆外层细胞,以及从克隆中迁出的细长细胞均表达神经前体细胞标志nestin;在相同RA浓度下,随着EG细胞分化时间的延长,TH+(tyrosine hydroxylase,TH)神经细胞的比例增加;而在不同RA浓度下,随着RA浓度的升高,TH+神经细胞的比例呈增加趋势,经RA诱导14 d,最高可获得(2.3±0.2)%的TH+神经细胞。【结论】昆明小鼠EG细胞在老化饲养层上高密度培养条件下,能自发分化为神经细胞,RA诱导可显著提高分化细胞群体中TH+神经元细胞的比例。试验建立的这种简单有效方法可用于EG细胞体外分化为神经细胞。     

猪类胚胎生殖细胞体外诱导分化为神经细胞的研究

【目的】探讨猪类胚胎生殖细胞向神经细胞分化的潜能。【方法】采用性腺-中肾区基质细胞与猪原始生殖细胞共培养的方法得到猪类胚胎生殖细胞,通过直接分化的方法进行神经细胞定向诱导。【结果】（1）与小鼠成纤维细胞作为饲养层相比,性腺-中肾区基质细胞作为饲养层同样能够支持猪类胚胎生殖细胞生长,二者对猪类胚胎生殖细胞的增殖能力不存在显著影响;（2）猪类胚胎生殖细胞有较强的碱性磷酸酶活性,Q-PCR结果显示多能性基因Oct4、Sox2及Nanog表达,增殖能力呈现“S”型,即生长的潜伏期、对数期及平台期,猪类胚胎生殖细胞经体外悬浮培养能够形成拟胚体;（3）经过诱导猪类胚胎生殖细胞能够分化形成表达神经干细胞、神经元及神经胶质细胞标记物的多种神经细胞类型。【结论】从早期性腺中成功分离培养得到了猪类胚胎生殖细胞,通过简单、快速的神经细胞分化的诱导体系证实了猪类胚胎生殖细胞具有体外定向分化为多种神经谱系细胞的能力。     

阻断大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化与肿瘤发生相关性研究

【目的】分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件.阻断正常干细胞的分化过程,探讨肿瘤发生机理.【方法】利用贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛联合诱导大鼠BMSCs,使其分化为脂肪细胞.在细胞分化过程中利用3-甲基胆蒽(3-MC)阻断大鼠BMSCs的分化过程.【结果】大鼠BMSCs分化试验显示:诱导30d后经油红O染色,细胞内可见脂肪细胞特有的红色脂滴沉淀,并且随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加,脂滴增大,表明大鼠BMSCs已成功分化为脂肪细胞.大鼠BMSCs分化阻断试验显示:诱导30d后经油红O染色细胞内红色脂滴沉淀明显下降,表明阻断后的细胞具有脂肪细胞的特性,但分化不完全;形态学鉴定表现出:细胞接触抑制消失,细胞核异常,微核畸变率高,核型异常,表明阻断后的干细胞发生恶性转变.【结论】通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛的联合作用,诱导BMSCs成功向脂肪细胞分化.在BMSCs向脂肪细胞分化的过程中加入阻断剂3-MC,阻断其分化过程,表明干细胞分化过程受到阻断,细胞停止在分化的中间阶段,有转化成肿瘤细胞的趋势.     

牛iPSCs向神经细胞的诱导分化

【目的】通过类胚体介导体外自由分化与诱导分化,验证所建立的牛诱导性多能干细胞(Bovine induced pluripotent stem cells,biPSCs)能否分化为外胚层的神经细胞。【方法】将biPSCs悬浮培养以制备类胚体,通过类胚体介导使biPSCs在添加全反式维甲酸(RA)和β巯基乙醇(β-Me)诱导体系中分化为神经细胞,比较其诱导效率;提取不同诱导体系的分化细胞与类胚体的总RNA,利用RT-PCR方法鉴定分化细胞中神经细胞特异性基因的表达。【结果】培养的biPSCs集落呈球形,中央隆起,周围界限清晰,与胚胎干细胞集落形态类似。biPSCs碱性磷酸酶(AP)染色为阳性,并表达SSEA-4干细胞特异性表面蛋白。biPSCs通过类胚体介导分化,在未添加化学诱导物的条件下,可自由分化为Nestin、GFAP与NSE阳性神经细胞,其阳性细胞率分别为(15.14±1.13)%,(6.25±0.35)%和(5.45±0.62)%;biPSCs在RA诱导组中分化的神经细胞的数量最多,诱导后表达Nestin、GFAP和NSE细胞的阳性率分别为(49.56±2.33)%,(16.58±1.28)%和(13.66±2.21)%;在β-Me诱导组中,表达Nestin的阳性细胞率为(42.23±1.25)%。2个诱导组的诱导效率与无化学诱导物组有显著差异(P0.05)。RT-PCR检测结果显示,不同诱导体系获得的分化细胞均能扩增到神经细胞特异性基因Nestin和βⅢ-Tubulin片段,产物长度与预期结果完全一致。【结论】biPSCs在体外具有向神经细胞发育的能力;RA是诱导biPSCs向神经细胞分化的良好诱导物。     

体外定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

[目的]分离和克隆小鼠骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经元样细胞。[方法]利用Percoll密度梯度离心的方法进行小鼠骨髓间充质干细胞分离及培养,分别采用β-巯基乙醇和BHA诱导分化为神经元样细胞。用神经元特异性烯醇化酶和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学方法对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。[结果]经2种诱导剂诱导的小鼠骨髓间充质干细胞均出现神经元样细胞的分化,胞体呈神经元状,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支。而且免疫细胞化学鉴定显示,诱导分化后的神经元样细胞神经元特异性烯醇化酶染色和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学染色均呈阳性,β-巯基乙醇诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（86.8±2.7）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（75.2±2.3）%;BHA诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（80.5±2.2）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（73.2±1.6）%。[结论]小鼠骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和BNA的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞。     

牛前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化

【目的】建立牛前体脂肪细胞的体外分离培养方法,研究牛前体脂肪细胞的生物学特性和分化特征,为研究牛脂肪发育和脂肪沉积的机制提供一种简便有效的细胞模型。【方法】采用Ⅰ型胶原酶消化法自新生牛脂肪组织中获得前体脂肪细胞,对培养的牛前体脂肪细胞进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色及脂肪细胞标志基因LPL、PPAR-r和脂联素表达研究。【结果】80%的牛前体脂肪细胞接种后12h开始贴壁,4d后开始向脂肪细胞转化,10d后绝大部分细胞脂滴融合,细胞脂肪含量增加;分离的牛前体脂肪细胞接种后1~2d生长缓慢,3~8d进入对数生长期,9d后进入平台期,之后细胞数目开始下降。经胰岛素诱导分化过程中,LPL在牛前体脂肪细胞分化的早期开始表达,PPAR-γ在分化的中期开始高度表达,而脂联素在牛前体脂肪细胞分化的前期未检测到,在细胞分化后期高度表达。【结论】用Ⅰ型胶原酶消化法可获得大量的牛前体脂肪细胞。培养的牛前体脂肪细胞成分均一、生长旺盛,经胰岛素诱导后能稳定的向脂肪细胞分化。     

转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化

 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CD144和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。     

Ca~(2+)信号介导川芎嗪诱导小鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的定向分化

用含2.4 mg.mL-1川芎嗪提取液对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行诱导,探讨川芎嗪体外诱导BMSCs分化为神经元样细胞的作用.应用EGTA(细胞外Ca2+螯合剂)、Nifedipine(L-型Ca2+通道阻断剂)和LY294002(PI3K阻断剂)等Ca2+阻断剂分别作用细胞,RT-PCR和Western blot技术研究Ca2+信号在川芎嗪诱导BMSCs分化为神经细胞过程中的作用.结果表明:川芎嗪作用不同时间的BMSCs均可见Nestin、β-Tubulin Ⅲ、NSE和Nurrl的表达;川芎嗪诱导后的细胞浆内Nestin和NSE蛋白表达呈阳性.EGTA、Nifedipine及LY294002分别阻断细胞外Ca2+、L-型Ca2+通道及PI3K后,NSE和Nurr1基因及NSE蛋白表达较川芎嗪诱导组显著上调.以上结果说明川芎嗪能使BMSCs定向分化为神经元样细胞,细胞内、外Ca2+的减少可促进川芎嗪诱导BMSCs向神经细胞的分化,Ca2+信号在川芎嗪诱导BMSCs向神经细胞定向分化过程中起负调控作用.     

成年昆明小鼠雄性生殖干细胞的分离培养及其多能性研究

【目的】从成年昆明小鼠睾丸组织中分离具有多能性的雄性生殖干细胞(Male germline stem cells,mGSCs)。【方法】采用机械法和2步酶消化法分离出成年昆明小鼠的精原细胞,经差速贴壁后,培养在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层上,2周后得到类胚胎干细胞(ESCs)样mGSCs。对得到的mGSCs进行碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色、RT-PCR、体内分化等检测。【结果】mGSCs具有类似ESCs的形态和多能性,AP染色呈阳性,免疫荧光Oct4、Vasa染色呈阳性,RT-PCR检测其表达Oct4、Nanog、Sox2等多能性基因和Vasa、C-kit等生殖细胞的标记基因,在免疫缺陷鼠体内能形成畸胎瘤,组织学检测其可形成包括3个胚层在内的多种类型细胞。【结论】从成年昆明小鼠睾丸分离的精原细胞,在体外培养去分化形成了具有类ESCs生物学特性的mGSCs,mGSCs既具有多能性,也具有生殖细胞的基本生物学特性。     

小鼠卵母细胞的孤雌激活与ES细胞样集落分离

对小鼠卵母细胞进行孤雌激活用于单性生殖研究。取成年昆明白小鼠进行超数排卵,乙醇激活,同小鼠输卵管上皮细胞共培养并添加mM16培养基培养至早期囊胚阶段,移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,换成ES细胞培养液继续培养,分离消化ICM,重新接种,对分离出的ES样细胞集落进行分离培养鉴定。结果显示,小鼠卵母细胞激活率为96.99%,2-细胞发育率为93.17%,桑椹胚发育率为80.33%,囊胚发育率为73.22%。小鼠孤雌激活囊胚中分离的ES样细胞集落具有一系列ES细胞所特有的特征,如呈现出岛屿状形态,碱性磷酸酶染色为阳性,体外能够自发分化成上皮样或单个散在分布的细胞等。试验证明,小鼠孤雌胚中可以分离出ES细胞样集落。     

小鼠ES细胞在不同饲养层上培养nanog基因的 表达水平与生长行为

观察小鼠ES-D3细胞在MEF、新生牛睾丸支持细胞(nBTSCs)和新生兔睾丸支持细胞(nRTSCs)饲养层上生长4dnanog基因的表达水平和生长行为。RT-PCR分析显示,MEF饲养层上培养4d的ES-D3nanog基因含量高;nBTSC饲养层上培养nanog基因表达较低;而RTSC饲养层上培养nanog基因表达最低。结果显示:不同饲养层上的ES-D3细胞集落形态和培养4d分化程度有差异。在MEF饲养层上的ES-D3细胞培养4d,集落形态仍然很规则,细胞间紧密,集落表面少见大细胞,AKP染色强阳性。在nBTSC饲养层上的ES-D3细胞,集落界限清晰,AKP染色显示,集落大部分细胞呈阳性,少数的细胞集落为弱阳性,可见集落表面分散有较多的大细胞。在nRTSC饲养层上的饲养层上的ES-D3,集落隆起不明显,集落界限不清晰,大部分集落形态不太规则,AKP染色显示集落中部分细胞呈阳性,少数的细胞集落为全阴性,集落表面有较少的大细胞,集落周围有伸出的成纤维细胞。     

ICR小鼠胚胎干细胞的分离、培养及鉴定

以小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层,收集受孕3.5 d ICR小鼠的囊胚和桑椹胚进行培养,筛选纯化ES细胞集落,使其稳定传代后,对其形态学和生物学性状进行初步鉴定。结果表明,ES细胞有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大;对ES细胞碱性磷酸酶进行检测,在AKP底物NBT、BCIP作用下,未分化的ES细胞显微镜下为黄褐色,分化的不着色;核型鉴定表明ES细胞具有正常的二倍体核型。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

为了确定大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离和培养的方法,建立了稳定的MSCs体外培养扩增体系,通过密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs,观察了细胞的形态,研究了其增殖及生长特征,并应用流式细胞术测定了细胞周期及CD29,CD44,CD45和HLA-DR的表达。结果表明,在体外培养条件下大鼠MSCs贴壁生长,为成纤维细胞样;CD45和HLA-DR的表达呈阴性,CD29和CD44的表达呈阳性;细胞周期的G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征。说明建立的体外培养扩增体系可获得形态单一、生长稳定、增殖性较强、较均一的大鼠MSCs。     

Characterization and Differentiation into Adipocytes and Myocytes of Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） could differentiate into various cell types including adipocytes and myocytes, which had important scientific significance not only in the field of tissue regeneration, but also in the field of agricultural science. In an attempt to exhibit the characterization and differentiation into adipocytes and myocytes of porcine BMSCs, we isolated and purified porcine BMSCs by red blood cell lysis method and percoll gradient centrifugation. The purified cells presented a stretched fibroblast-like phenotype when adhered to the culture plate. The results of flow cytometry analysis and immunofluorescence staining demonstrated that the isolated cells were positive for mesenchymal surface markers CD29, CD44 and negative for hematopoietic markers CD45 and the adhesion molecules CD31. Cells were induced to differentiate into adipocytes with adipogenic medium containing insulin, dexamethasone, oleate and octanoate. Oil Red O staining demonstrated that the porcine BMSCs successfully differentiated to adipocytes. Moreover, the findings of real-time PCR and Western blotting indicated that the induced cells expressed adipogenic marker genes （PPAR-y, C/EBP-c~, perilipin, aP2） mRNA or proteins （PPAR-3,, perilipin, aP2）. On the other hand, porcine BMSCs were induced into myoctyes with myogenic medium supplemented with 5-azacytidine, basic fibroblast growth factor, chick embryo extract and horse serum. Morphological observation by hochest 33342 staining showed that the induced cells presented as multi-nucleus muscular tube structure. And myogenic marker genes （Myf5, desmin） mRNA or proteins （MyfS, MyoD, myogenin, desmin） were found in the induced cells. In addition, the results of immunofluorescence staining revealed that myogenic marker （Myf5, MyoD, myogenin, desmin, S-MyHC） proteins was positive in the induced cells. Above all, these results suggested that the isolated porcine BMSCs were not only consistent with the characterization of mesenchymal stem cells, but also exhibited the multipotential capacity to form adipocytes and myocytes, which provided the basis to investigate the regulation mechanism involved in the selective differentiation of porcine BMSCs.     

八肽胆囊收缩素对骨髓间充质干细胞诱导分化后神经元样细胞生长状态的影响

为探讨八肽胆囊收缩素(CCK8)对骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化后神经元样细胞生长状态的影响,在β-巯基乙醇诱导MSCs分化的基础上加入CCK8,观察诱导期间细胞形态变化及分化细胞的存活时间,免疫细胞化学法鉴定神经元特异性巢蛋白(Nestin)的表达,唑盐比色实验(MTT)法检测细胞活性。结果表明,加入CCK8的部分实验组与基础诱导组相比,可延长神经元样细胞的生存时间;诱导后5 h,Nestin阳性表达率变化不明显(P>0.05),诱导后10 h,神经元样细胞的活性可明显增强(P<0.05)。该结果说明,CCK8在β-巯基乙醇体外诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞后的过程中,可一定程度延长细胞的存活时间,具有抗细胞凋亡作用。     

湖羊精原干细胞体外培养

研究了湖羊精原干细胞(SSCs)体外培养方法,湖羊睾丸曲精细管两步酶消化法制备细胞悬液,Percoll分离后比较SSCs纯化方法、FCS以及GDNF对SSCs体外培养与集落碱性磷酸酶(AKP)染色的影响。结果显示,虽然盘化法纯化的SSCs在集落形成时间与集落数上显著低于差速贴壁法(P<0.05),但是盘化法所得集落的AKP阳性率显著高于差速贴壁法(P<0.05);添加1% FCS的培养基可显著降低集落形成的时间,增加集落的数目与AKP阳性率(P<0.05),但集落形成时间与AKP阳性率在5%与1% FCS之间无显著变化(P>0.05);20 ng/mL GDNF处理组内集落数与AKP阳性率显著高于10 ng/mL GDNF(P<0.05),但集落形成时间与AKP阳性率与30～40 ng/mL GDNF的处理组无显著差别(P>0.05)。     

鸭胚睾丸支持细胞的分离培养与鉴定

为探究鸭胚睾丸支持细胞的分离培养方法,选取２４日胚龄的麻鸭鸭胚４０个,取出睾丸,采用胶原酶Ⅳ与胰蛋白酶二步消化分离睾丸细胞,差异贴壁与低渗处理的方法进行纯化,于３７℃,体积分数５％二氧化碳条件下培养,最终得到纯度较高的支持细胞．经染色鉴定,发现罗丹明１２３染色显示支持细胞中富含线粒体;ＡＫＰ检测发现８０％的细胞呈ＡＫＰ阴性;吖啶橙染色显示支持细胞细胞质中富含ＲＮＡ;油红Ｏ染色显示睾丸支持细胞细胞质中含有大量脂肪滴,细胞核内可见双极小体．本试验结果说明采用胶原酶Ⅳ与胰蛋白酶结合消化,经差异贴壁与低渗出处理纯化,可得到较高纯度的支持细胞;结合罗丹明１２３染色法、ＡＫＰ染色法、吖啶橙染色法与油红Ｏ染色法可有效鉴定支持细胞．     

Improved Isolation and Culture of Embryonic Germ Cells from Guanzhong Dairy Goat

A total of 219 embryonic-germ-cell-like （EG-like） clumps were derived from 15 selected goat fetuses. Isolation of primordial germ cells （PGCs） based on co-culture with primary goat embryonic fibroblast showed no difference from traditional feeder layer-based culture method used in mouse and human. The putative primary EG colonies were multilayer clumps of compact cells with unclear cell-cell boundaries. Three subculture methods of goat EG-like colony, traditional enzymatic digestion, mechanical cutting and combination of the both, were compared in this study. As a result, EG-like colonies traditionally disassociated with collagenase 1V could be subcultured for up to 4 passages. And the mechanically disaggregated EG-like colonies were successfully maintained 9-12 passages with or without enzymatic treatment. The pluripotency of the EG-like colonies was identified by their specific marker staining, spontaneous differentiation and embryoid bodies （EBs） formation in vitro. Most goat EG-like colonies （〉 80%） were AKP positive and immunocytochemically characterized with positive SSEA-1, Oct-4 and c-kit staining but SSEA-4. Under the condition of delaying passage, goat EG-like cells could differentiate into fibroblast-like, epithelium-like, and neuron-like cells. In addition, EBs could be obtained successfully in routine hanging drop culture. The serum free culture system （feeder layer-based） used in this study was suitable for keeping PGCs and EG-like cells in their undifferentiated condition, but failed to converse them to immortal cells. These results indicated that mechanical cutting is an effective method for passaging goat EG cell colonies. However, the microenvironment of conversing EG cells to immortal cells is still unclear.     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养

为探讨体外分离及培养扩增兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,无菌采取兔股骨,用含20%FBS的DMEM培养液冲骨髓腔,采用全骨髓细胞贴壁培养法对MSCs进行纯化扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况、绘制细胞生长曲线。结果显示,MSCs为贴壁生长细胞,形态均匀呈纤维样,增殖能力强,多次传代仍能保持其生物学特性。采用全骨髓贴壁培养法能够较好地纯化和扩增MSCs。