基因组步移技术克隆稀有鲫角蛋白18基因序列及序列分析

角蛋白18是角蛋白的一种,属于S型角蛋白,是在哺乳动物和两栖类动物胚胎发育中第一个表达的中间纤维蛋白。根据已发表的人、爪蟾及斑马鱼角蛋白18 DNA序列,通过DNAman同源性比较获得保守序列,并从中设计二对引物。从稀有鲫基因组中PCR扩增得到2 779 bp的角蛋白18的DNA序列片段;通过基因组步移,分别获得该基因的上游和下游序列片段;最后将获得的全基因片段克隆至质粒载体pMD19-T进行序列测定检验。结果显示所克隆的稀有鲫角蛋白18基因全长3 765 bp。对该基因进行NCBI的Blastn同源性比较分析,表明稀有鲫同斑马鱼比较角蛋白18 DNA序列存在73.6%同源相似性;同时对该基因进行生物学分析,开放阅读框(Open ReadingFrame,ORF)预测表明稀有鲫角蛋白18是含有7个外显子和6个内含子,共编码367个氨基酸的蛋白质。研究亮点:首次成功克隆了稀有鲫角蛋白18基因全长序列3 765 bp,并且通过软件预测分析得出氨基酸序列,把氨基酸序列在DNA序列中进行标记,显示稀有鲫角蛋白18基因全长序列含有7个外显子和6个内含子,共编码367个氨基酸。另外,没有采用常用的从RNA反转...     

稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因全序列的克隆与分析

稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）是我国特有的一种小型鲤科鱼类,目前已作为一种新型模式生物应用于实验研究。运用普通PCR方法克隆得到一段长6 299 bp的序列,序列分析发现编码区与稀有鮈鲫卵黄蛋白原cDNA序列相似性为100%。再参考6 299 bp序列5′端设计两对特异性引物,进行基因组步移,获得长度为1 285 bp的序列。经过序列拼接后得到7 573 bp的序列,分析发现其中含卵黄蛋白原基因全序列长度为 6 595 bp卵黄蛋白原基因上游调控序列长度为978 bp。进一步分析开放性阅读框得知：稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因含有26个外显子和25个内含子,编码1 299个氨基酸序列,CDS长3 900 bp。经BLAST比对发现,稀有鮈鲫卵黄蛋白原上游调控序列中220～838 bp区间与朝鲜（Acheilognathus yamatsutae）卵黄蛋白原基因启动子序列2 857～3 469 bp 区间有80 %相似性。     

一品红转化酶基因片段的克隆和序列分析

根据植物酸性转化酶基因的保守区序列,设计1对PCR引物,以一品红基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约500 bp的DNA片段,克隆入pM D-18T载体,测序结果表明:获得1个一品红酸性转化酶基因家族的成员,该基因片段长523 bp,编码173个氨基酸,属于开放阅读框的一部分,不含内含子。在G enB ank中进行同源性检索的结果表明,该成员编码的氨基酸与其他植物细胞壁酸性转化酶编码的氨基酸同源性较高。     

枇杷β-胡萝卜素羟化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物β-胡萝卜素羟化酶基因的保守区序列,设计1对PCR引物,以枇杷基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约450 bp的DNA片段,克隆人pMD-18T载体中,测得该基因片段长为440 bp,编码145个氨基酸,属于开放阅读框的一部分,不含内含子。在GenBank中进行同源性检索,结果该序列与苹果β-胡萝卜素羟化酶基因同源性为95%,证明它属于枇杷的β-胡萝卜素羟化酶基因。     

黄瓜异戊烯基转移酶基因的克隆及序列分析

根据GenBank拟南芥ATIPTs基因序列设计特异性引物,采用PCR方法从黄瓜S94基因组DNA中克隆出异戊烯基转移酶基因保守区片段;再通过对黄瓜基因组BAC文库的筛选,获得基因的全长序列,命名为cs-ipt,GenBank登录号HQ326777.经序列测定及分析表明,该基因编码序列全长1 005 bp,编码334个氨基酸,氨基酸序列中包含有ATP/GTP结合位点GATGTGKS.同源比对表明该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他植物的ipt基因都有较高的同源性,其中与杨树的同源性最高为65%.     

山核桃FLOWERING LOCUST同源基因的克隆与序列分析

根据不同植物FLOWERING LOCUST（FT）同源基因序列的保守区,设计合成1对长度为18bp的PCR简并引物,以山核桃基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长度为152bp的DNA片段,克隆到pMD19-T载体上。测序及序列分析结果表明,扩增所获得的片段序列为FT基因第四外显子部分序列,不含内含子,推测共编码50个氨基酸;其序列在GenBank中注册号为FJ858260．1,同源性比对结果表明,其氨基酸序列与其他植物FT基因的同源性高达88％～96％。     

甘薯抗线虫病相关基因片段克隆及序列分析初步研究

依据甜菜抗线虫病基因(Hs1pro-1)序列设计引物片段,对甘薯高抗线虫病品种金山25的总DNA进行PCR扩增,获得1条600 bp左右的特异片段.序列测定及同源性检索表明,克隆序列与甜菜的Hs1pro-1基因具有一定的同源性.     

枇杷LEAFY同源基因的克隆及序列分析

为从分子水平研究枇杷成花的机理,通过分析植物花分生组织决定基因LEAFY(LFY)同源基因的保守区序列,设计了1对简并引物,用PCR方法从枇杷栽培品种‘早钟6号’基因组DNA中扩增出1个1317bp的片段,把该片段克隆到pUCm-T载体,测序和序列分析结果表明获得了枇杷LFY同源基因(ejLFY)3’端的1个片段,该片段有1个911bp的内含子,编码区共编码130个氨基酸,其序列已经在GenBank中登记(登录号为AY551183)．在GenBank中进行同源性搜索,发现该基因片段与其他作物中已经报道的LFY同源基因的同源性大都在94％以上,特别是与同属于蔷薇科的苹果的同源性最高,达到98％的同源性,推测它们具有相似的功能．     

金柑LEAFY同源基因克隆与全序列分析

通过PCR扩增，从融安金柑基因组DNA中克隆出一条2361bp的DNA片段，该DNA克隆含有1个2081bp的LEAFY同源基因全长序列（FcLFY）。金柑LEAFY同源基因包含2个内含子和3个外显子，编码398个氨基酸。比对结果表明，金柑LEAFY同源基因与甜橙、枳的LEAFY同源基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为98％。该研究为今后从分子水平上研究金柑开花调控机理打下了坚实的基础。     

胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆与序列分析

以胡萝卜幼苗为材料,提取基因组DNA,根据GenBank中的已知序列设计引物,利用聚合酶链式反应技术(PCR)体外扩增获得胡萝卜抗冻蛋白基因(AFP),将其连接到pGEM-Teasy vector载体上,并对其进行生物学信息分析.结果表明:克隆的AFP基因片段全长1 206bp,其中编码区长1 026bp,共编码341个氨基酸,蛋白质分子量为38.048ku,等电点为5.43,该蛋白为亲水性分泌型蛋白,有信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主.与GenBank中(A91926.1)的基因序列和氨基酸序列比较,同源性分别为99.4%和97.6%,表明AFP基因克隆成功.与不同地方品种胡萝卜AFP基因做同源性比较,结果发现不同品种间的AFP基因保持着很高的内同源性.     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。     

4种蝴蝶雄性生殖系统形态学研究

【目的】明确4种蝴蝶雄性生殖系统的形态学结构。【方法】将新鲜标本剪下腹部,在Motic SMZ168-BL型显微镜下观察解剖,用Q Imaging Retiga 2000R(CCD)显微成像系统照相,采用Montage图像叠加软件进行图像处理。【结果】描述了4种蝴蝶的雄性生殖系统,其中外生殖器的差异主要表现在囊形突、钩突、背兜、阳基轭片等上,而内生殖器的主要差异表现在精巢、复射精管、单射精管及附腺上。【结论】4种蝴蝶雄性生殖系统的各部分结构特征存在较大差异。     

乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究

【目的】观察乌梅Fructus mume等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通过乙醇回流、水煎煮和超声波等方法对20种中药进行提取,采用二倍稀释法测定其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性;并研究抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌活性.【结果和结论】乌梅、黄连Rhizoma coptidis、诃子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)范围是6.25~50.00 mg/mL;大青叶Isatis indigotica、茵陈Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鲜皮Dictamnus dasycarpus 4种中药提取物的MIC范围是50.00~100.00 mg/mL;黄柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金银花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板蓝根Baphicacanthus cusia、栀子Gardenia jasminoides和黄芪Astragalus membranaceus等10种中药提取物的MIC100.00 mg/mL.联合抑菌试验结果表明,乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合抑菌指数(FICI)≤1,乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI2.乌梅、黄连、诃子、虎杖、秦皮、地榆对胸膜肺炎放线杆菌均具有较好的体外抗菌活性;乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合为相加、协同作用;秦皮分别与乌梅、虎杖为拮抗作用.     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究

【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。     

孟加拉鲥、美洲鲥和中国鲥形态学比较分析

观察、解剖107尾孟加拉鲥Tenualosa ilisha、美洲鲥Alosa sapidissima和中国鲥Tenualosa reevesii,详细记叙了孟加拉鲥外部形态和内部结构,运用传统形态学方法比较分析了3种鲥鱼的形态差异.三者形态7项可量性状比值的聚类分析结果显示,孟加拉鲥和中国鲥先聚为一类,再和美洲鲥聚为一类,这与它们的分类地位相一致.外观上,孟加拉鲥臀鳍鳍条短,被1层薄鳞覆盖;美洲鲥的纵列鳞数及体长/体高、体长/头长都大于其他2种鲥鱼.可数性状上,第一外鳃弓鳃耙和脊椎骨数目能明显区分3种鲥鱼.孟加拉鲥、中国鲥和美洲鲥的第一外鳃弓鳃耙数分别为181～219+153～224、95～131+170～175和24～31+47～55;脊椎骨数分别为46～48、37～39和55～57.在内部结构上,根据胃的形状、盲囊部的大小、幽门垂的长短和数量、肠道的弯曲数目及相对长度可以准确鉴定这3种鲥鱼.孟加拉鲥肠道最长,中国鲥次之,美洲鲥肠道最短.3种鲥鱼在消化道结构的差异,预示食性已产生分化.     

蜡蚧轮枝菌V3450菌株对榕管蓟马及斯氏钝绥螨的毒力比较

【目的】比较蜡蚧轮枝菌V3450菌株对榕管蓟马及斯氏钝绥螨的毒力差异,为利用天敌昆虫和虫生真菌协同控制榕管蓟马等害虫提供技术支持。【方法】室内测定榕管蓟马成虫和斯氏钝绥螨雌成螨受蜡蚧轮枝菌V3450菌株侵染后的死亡趋势,构建时间-剂量-死亡率(TDM)模型,比较供试菌株对榕管蓟马成虫及斯氏钝绥螨雌成螨的LC50和LT50。【结果】蜡蚧轮枝菌V3450菌株侵染后,榕管蓟马和斯氏钝绥螨的死亡趋势均随菌剂浓度的升高及侵染时间的延长而上升,但榕管蓟马的累计校正死亡率及死亡趋势的变幅均明显高于斯氏钝绥螨,其中1.00×107和1.00×108 mL-1蜡蚧轮枝菌V3450菌株侵染10d,斯氏钝绥螨雌成螨的累计校正死亡率分别仅是榕管蓟马成虫的13.30%和27.94%。构建的榕管蓟马和斯氏钝绥螨TDM模型均能通过Pearsonχ2和Hosmer-Lemeshow检验,拟合结果与试验观察结果相吻合,能够无偏地描述蜡蚧轮枝菌V3450菌株对榕管蓟马成虫和斯氏钝绥螨雌成螨的时间-剂量互作效应。蜡蚧轮枝菌V3450菌株对榕管蓟马的剂量和时间效应均明显强于斯氏钝绥螨,5个不同浓度蜡蚧轮枝菌V3450菌株对斯氏钝绥螨雌成螨的LT50均超出TDM模型估测范围,斯氏钝绥螨雌成螨受侵染3d后的LC50是同一侵染时间榕管蓟马成虫LC50的2.51×102~1.29×105倍。【结论】蜡蚧轮枝菌V3450菌株对榕管蓟马的毒力较强,而对斯氏钝绥螨的毒力较弱,榕管蓟马对供试菌株时间-剂量互作效应的响应要远强于斯氏钝绥螨。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。