转Bt基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅰ.Bt菌HD-1的杀虫晶体蛋白抗原制备

研究了培养时间对苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)HD-1菌株孢晶混合物的产量、杀虫晶体蛋白裂解液的种类和处理温度与时间对杀虫晶体蛋白提取率及纯度的影响。结果表明BtHD-1菌株在Bt生长繁殖平板培养基上,30℃下培养41～55h均可获得大量孢晶混合物。采用50mmol/LNa2CO3裂解液处理孢晶混合物,可获得纯度高的130kD杀虫晶体蛋白,而用40mmol/LNaOH提取的杀虫晶体蛋白中含有较多杂蛋白。所研究的处理温度和时间对杀虫晶体蛋白提取量和组成无明显影响。这些结果为杀虫晶体蛋白抗原的制备提供了依据。     

利用Dot-ELISA检测Bt棉杀虫蛋白的研究

用苏云金芽孢杆菌HD-1和HD-68晶体杀虫蛋白的碱溶产物作为抗原,制备相应的抗血清,建立了检测Bt杀虫蛋白的Dot-ELISA,可检测Bt杀虫蛋白的最低水平为87.5ng/ml。用Dot-ELISA对2个转基因抗虫棉和它们的亲本进行了检测,并与生物学测定的抗虫性进行比较,结果基本一致。因此,对测定大批量转基因抗虫棉的抗虫性,Dot-ELISA是一个快速、敏感、特异、有效的方法。     

利用ELISA检测新疆转基因抗虫棉组织中Bt杀虫蛋白

利用抗体一抗原一酶标抗体反应,建立了酶联免疫吸附测定法(ELISA),检测转基因抗虫棉中Bt杀虫蛋白的表达。这一检测方法不仅对转基因抗虫棉组织中Bt杀虫蛋白表达量进行定性、定量测定,也对转基因抗虫棉的选育和抗虫性测定提供了依据。     

双峰驼血清IgG纯化及其抗血清制备

纯化双峰驼血清IgG并制备兔抗骆驼IgG抗血清,为制备针对特定蛋白的特异性纳米抗体储备材料,利用Protein G纯化双峰驼血清IgG,并用纯化的IgG免疫成年家兔后采用ELISA方法检测抗血清效价;采用间接ELISA方法,利用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体水平,Western blot技术检测制备的抗血清与从噬菌体纳米抗体库中筛选到的针对不同蛋白的纳米抗体的反应性,以确定抗血清的适用性。结果显示,从双峰驼血清中纯化到骆驼IgG,SDS-PAGE分析显示纯化的骆驼IgG包括3条链,约50ku的传统重链IgG1,约43ku缺失CH1的重链IgG3和约30ku的传统轻链;3次免疫后兔抗骆驼IgG抗血清效价达1∶512 000;应用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫5次的双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体效价达1∶1 024 000;制备的抗血清可以与原核表达的针对不同病毒蛋白的纳米抗体反应;说明制备的兔抗骆驼IgG抗血清可用于免疫骆驼血清和表达的纳米抗体的检测。研究结果为目标蛋白免疫骆驼后抗体效价检测及纳米抗体文库构建提供关键材料。     

卵形鲳鲹IgM蛋白的纯化和抗血清的制备

为了获得卵形鲳鲹血清免疫球蛋白(Ig M),笔者首先采用硫酸铵二次盐析法对Ig M进行粗提,然后利用蛋白A亲和层析法进行纯化,并以纯化后的Ig M蛋白为抗原,制备该蛋白的多克隆抗体,最后利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Western blot技术检测所获抗血清的效价及效果。结果表明:用饱和硫酸铵二次盐析法提取的蛋白除了重链和轻链2条电泳带外,杂蛋白较多;利用蛋白A亲和层析法可获得纯度较高的Ig M重链和轻链。用纯化的卵形鲳鲹Ig M免疫小鼠,ELISA方法检测获得的多抗血清效价高达1∶25 600。Western blot结果显示,本实验制备的鼠抗卵形鲳鲹Ig M血清可结合显示出目标条带,说明卵形鲳鲹Ig M多克隆抗血清制备成功,为卵形鲳鲹的后续研究工作奠定了基础。     

抗莱克多巴胺多克隆抗体的制备

为了制备抗莱克多巴胺多克隆抗体,试验通过连接剂butane-1,4-diol diglyciydyl ether把莱克多巴胺和载体蛋白BSA和OVA偶联成免疫抗原和包被抗原,免疫新西兰大白兔,饱和硫铵沉淀方法纯化抗体,间接ELISA法检测抗血清效价。结果通过免疫兔获得了抗莱克多巴胺的多克隆抗体。经ELISA测定,其效价为1∶12800。     

特异性RBBP10多克隆抗体的制备

目的: 制备RBBP10多克隆抗体.方法:用纯化的RBBP10蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,stern印迹检测抗体特异性.结果:抗血清效价可达1:1000以上.结论:经Western印迹检测证明抗体效价高,特异性强,此抗体可通过免疫组化方法检测RBBP10蛋白在各种肿瘤中的表达,具有一定的应用价值.     

抗磷酸酪氨酸抗体的制备

目的；制备抗磷酸酪氨酸抗体。方法：以EDC（碳化二亚胺）交联法合成磷酸酪氨酸牛血清白蛋白（P－Tyr－BSA）；以P－Tyr－BSA免疫新西兰免，抗血清经硫酸该盐析和DEAE纤维素柱层析纯化；以琼脂糖双扩法测定抗体效价。结果：得到抗血清效价为1：32，抗血清与牛血清蛋白（BSA）交叉反应的效价为1：2。纯化的抗体与磷酸酪氨酸牛血清白蛋白、磷酸酪氨酸卵清蛋白、磷酸丝氨酸牛血清白蛋白、磷酸苏氨酸牛血清白蛋白反应效价分别为1：32、1：16、1：2、1：2，所得抗体蛋白量为120mg。纯化的抗体在醋酸纤维素薄膜上电泳为单一区带。结论：用此法制备得的抗体专一性高，交叉反应低，抗体量大。     

鸡PERK的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(15~1 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的表达量最大.蛋白纯化结果表明,100 mmol·L-1咪唑洗脱液可较好地洗脱重组蛋白,获得较多的纯化蛋白.免疫结束后,抗体效价检测结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶32 000,可以与重组蛋白特异结合.     

斑马鱼SAA蛋白原核表达、抗体制备及菌结合试验

通过构建斑马鱼(Danio rerio)SAA原核表达载体,在大肠杆菌(E.coli)TB1中诱导表达并纯化获得了斑马鱼SAA融合蛋白,将纯化的斑马鱼SAA蛋白免疫Balb/c小鼠,制备了特异性多克隆抗血清,并研究了斑马鱼SAA融合蛋白与细菌的结合能力及检测了抗体效价。结果表明,纯化的斑马鱼融合SAA蛋白能够与5种细菌直接结合,血清效价达到1∶2 000以上。     

原核表达的兔出血症病毒衣壳蛋白对兔的免疫保护效果

 为了检验大肠杆菌表达的兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白（VP60）对兔的免疫保护效果，将34只清洁兔随机分成3组：单用免疫佐剂对照组（8只）、单用重组VP60组（8只）和重组VP60加免疫佐剂组（18只），分别经皮下注射，VP60的免疫剂量为每只每次400 μg，免疫2次，间隔7 d。在第2次免疫7 d后，VP60加免疫佐剂组的兔血清抗体水平显著高于单用VP60免疫组（ELISA 1∶64 000 对比1∶4 000 / HI 1∶128 对比1∶16），表明免疫佐剂可明显加速重组VP60诱导抗体产生的进程，用RHDV NJ85强毒攻击，免疫佐剂对照组与单用VP60免疫组的实验兔均全部死亡（8/8和8/8），VP60加免疫佐剂组均全部存活，保护率为100%（18/18）。用RHDV血凝试验（HA）检测，死亡兔的肝脏组织液HA效价大于1∶512，而存活兔的肝脏组织液HA效价小于1∶2，肝脏组织触（涂）片检查和细菌培养均为阴性，证明病死兔系RHDV感染所致。用RHD重组亚单位疫苗在养兔场进行800只兔的田间免疫试验，安全有效，没有出现不良反应。对重组菌进行冻存、复苏、培养、诱导表达和质粒酶切分析，证明VP60基因在宿主菌内保持稳定。     

尼罗罗非鱼对嗜水气单胞菌的免疫反应

将嗜水气单胞菌用福尔马林灭活后,接种尼罗罗非鱼,测定其血清凝集抗体效价及攻毒后的免疫保护力。结果表明,灭活菌苗对尼罗罗非鱼有较强的免疫原性,免疫鱼具有很强的免疫保护力。小个体鱼的浸浴接种效果强于大个体。     

丙烯酰胺人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

摘 要：利用偶联方法合成丙烯酰胺人工抗原,通过免疫方法获得抗丙烯酰胺多克隆抗体;应用戊二醛法将丙烯酰胺与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,并对这两种物质及其复合物进行紫外扫描,并用此复合物免疫兔子,利用间接酶联免疫吸附法测定抗体的效价;应用牛血清白蛋白与丙烯酰胺偶联人工抗体成功,抗体效价大于8100;应用人工抗原免疫成功制备抗丙烯酰胺多克隆抗体。     

抗异丙隆多克隆抗体的研制

 【目的】为了建立测定脲类除草剂异丙隆残留的免疫分析方法（ELISA），对制备高效价抗异丙隆多克隆抗体的方法进行了研究。【方法】以对异丙基苯基异氰酸酯、N-甲基吡咯环酮和N-甲基己内酰胺为反应原料，经两步化学反应合成了两种异丙隆半抗原：1-(3-丙基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲（HAPTEN 4C）和1-(5-戊基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲（HAPTEN 6C）。通过活性酯法将半抗原与载体蛋白(BSA、OVA)偶联制备了两种异丙隆的人工抗原HAPTEN 6C-BSA和HAPTEN 4C-OVA。利用免疫抗原HAPTEN 6C-BSA免疫新西兰大白兔获得了高效价的异丙隆的多克隆抗体。建立了以HAPTEN 4C-OVA为包被原的间接竞争ELISA方法。【结果】合成的半抗原经薄层色谱、IR、1HNMR确证；人工抗原HAPTEN 6C-BSA和HAPTEN 4C-OVA的结合比分别为46﹕1和36﹕1。抗血清的最高效价为1.6105。经优化确定的间接竞争ELISA分析方法中包被抗原的浓度为0.1 g•ml-1,抗血清的工作稀释倍数为1.0×105。根据异丙隆的标准抑制曲线，异丙隆对免疫反应的的IC50值为0.07 g•ml-1。抗体对氯溴隆、绿谷隆、特丁塞隆等6种取代脲类除草剂的交叉反应率都小于0.1%。【结论】异丙隆是小分子，本身没有免疫活性，也没有与载体蛋白偶联的活性基团。高效价、高特异性抗体的制备是利用免疫学方法进行异丙隆残留分析的最关键因素。本研究合成的两种异丙隆的相似物具有不同长度碳链的羧基，并且使异丙基和苯基充分暴露，具备了异丙隆半抗原的特点。将半抗原偶联到载体蛋白上获得的人工抗原经免疫兔子后获得了高效价、高特异性的抗异丙隆抗体。     

梅花鹿生茸骨膜干细胞可溶性总蛋白抗体的制备及滴度测定

为了获取梅花鹿生茸骨膜干细胞可溶性总蛋白抗体。本试验培养了梅花鹿生茸骨膜干细胞,从该细胞中提取可溶性总蛋白。以其可溶性总蛋白为抗原,通过淋巴结和皮下注射两种方式免疫试验动物,注射的抗原量分别为70μg/只和280μg/只。分别于末次免疫后第10天和第20天采血,分离血清,通过ELISA试验检测血清中抗体滴度。结果表明,280μg皮下免疫和70μg淋巴结免疫均获得了较好的免疫效果,末次免疫后第10天的抗体滴度较高。     

鸡传染性法氏囊病高免血清的制备与检验

[目的]探索一种新的制备鸡传染性法氏囊病高免血清的方法。[方法]采用IBDV灭活苗对27日龄SPF鸡作基础免疫,活疫苗作3次加强免疫,四免后21 d采血制备高免血清。[结果]试验结果表明随着免疫次数的增加,试验鸡IBD中和抗体滴度逐步增加,一免和二免后中和抗体分别为12 log2和13 log2,三免和四免后中和抗体达到最高值15 log2。[结论]采用该方法免疫SPF鸡,有效保护了法氏囊不受损伤,3次免疫即可获得高效价的IBDV抗血清。     

转基因玉米表达的猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白免疫原性鉴定

为鉴定猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(TGEV-S)在转基因玉米中的表达及对试验小鼠的免疫原性,本试验在前期TGEV-S转基因玉米植株构建成功的基础上,自玉米叶片中抽提可溶性蛋白作为包被抗原,建立筛选表达TGEV-S转基因玉米的间接ELISA检测方法。结果显示在92份被检测植株中8株为阳性,取阳性值较高的2株152-3和156-6,提取叶片可溶性蛋白,与弗氏佐剂乳化后皮下注射免疫小鼠,只有植株156-6中可溶性蛋白免疫小鼠可产生针对TGEV的抗体,而152-3免疫组检测结果为阴性。利用156-6植株叶片对小鼠进行灌胃免疫,也可产生针对TGEV的特异性抗体。以上结果表明,获得的TGEV-S转基因玉米植株不但可表达TGEV-S蛋白,而且该蛋白通过注射或口服途径免疫小鼠后均可产生针对TGEV-S的特异性抗体,提示TGEV-S转基因玉米具有发展成为TGEV口服疫苗的潜力。     

C型肉毒梭菌肉毒毒素的抗原性分析

[目的]通过对分离纯化的C型肉毒毒素抗原性分析,提供快速鉴定动物因C型肉毒梭菌中毒的理论基础.[方法]对分离纯化的C型肉毒梭菌的肉毒毒素灭活后通过SDS - PAGE测定浓度,确定浓度后与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,免疫结束后采家兔血液并分离血清.[结果]将不同稀释倍数的肉毒毒素经SDS -PAGE电泳分离后,转移至HybondNC膜,家兔三免后提取的血清作为一抗,用二抗进行Western blotting检测,大约在98.0和53.0 kDa处出现特异反应带;抗原与抗体在琼脂凝胶上结合时,会形成清晰的沉淀带.[结论]分离纯化的C型肉毒毒素,经免疫后家兔可见:C型肉毒毒素具有免疫原性和反应原性,抗体的效价为1∶8.     

苯巴比妥人工免疫原合成及抗体特性研究

将苯巴比妥(PB)经硝化和还原两步化学修饰后,在其苯环上引入活性基团氨基,合成具有半抗原结构特征的对氨基苯巴比妥(pAPB);用重氮化法将pAPB偶联于栽体蛋白BSA和OVA上,合成人工免疫原BSA-pAPB和包被抗原OVA-pAPB,用红外(IR)、紫外(UV)、SDS-PAGE进行鉴定,推算分子结合比;用BSA-pAPB免疫新西兰白兔和SPF雏鸡,间接ELISA测定多克隆抗体(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性.WestGold层析试验和交叉反应试验鉴定其特异性.结果表明,BSA-pAPB偶联成功,分子结合比为1:19:获得了高价、敏感、特异的pAb,为PB残留免疫学检测方法的建立奠定了基础.