瘤胃微生物基因组文库中BAC末端序列分析

基于前期从瘤胃微生物基因组文库中筛选的功能酶克隆菌,利用T7和pIBRP引物,测定功能酶克隆菌的BAC末端序列,并利用NCBI Blast系统对BAC末端序列进行分析.结果表明:共得到26条BAC末端序列,经Blast比对分析,与已知编码基因的匹配度低,而大部分BAC末端序列与阪崎肠杆菌和环境中的微生物匹配度高,说明瘤胃中的微生物与其它环境中的微生物具有一定的相似性,进一步丰富了对瘤胃微生物的认识.     

大麦BAC文库三维混合池的构建与HvGW2筛选

【目的】从大麦BAC文库中快速筛选包含目的基因HvGW2的阳性BAC克隆。【方法】构建BAC文库三维混合池,设计2对HvGW2特异性引物,进行BAC文库筛选,对含有目的基因HvGW2的阳性BAC克隆进行测序,获得编码大麦GW2蛋白的基因组DNA序列,并与禾本科中的GW2进行同源进化分析。【结果】构建了大麦BAC文库的三维混合池160个,文库空载率为0.18%;筛选到含HvGW2的阳性BAC克隆3个,其中,BAC克隆196M02包含完整编码该基因的序列;HvGW2包含8个外显子和7个内含子,具有与其它植物GW2相似的结构特征和保守的功能结构域;同源进化分析结果显示,大麦与小麦的GW2蛋白同源性最高;序列分析发现,HvGW2第6内含子上包含2个不同类型的反转录转座子插入,从而使大麦比其它作物的GW2长度增加11.5 kb以上。【结论】通过构建三维混合池快速筛选包含目的基因的单个阳性BAC克隆,建立了大麦目标基因克隆的辅助平台;HvGW2基因组中位于内含子区的反转录转座子插入导致基因长度增加,可能是影响该基因转录水平的关键变异。     

琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选

【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。     

凡纳滨对虾类泛素折叠修饰蛋白Ufm1基因

【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白(Ufm1)的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufm1基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufm1基因,经全长cDNA文库筛选获得Ufm1基因全长序列。【结果】Ufm1基因全长cDNA序列长714 bp,包含261 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9.3 ku,等电点pI为6.55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufm1基因存在较高的同源性。【结论】Ufm1基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufm1基因功能及原核表达等奠定了基础。     

凡纳滨对虾类泛素折叠修饰蛋白Ufm1基因克隆、序列分析及结构预测

【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白（Ufml）的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufml基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减。DNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufml基因,经全长cDNA文库筛选获得ufml基因全长序列。【结果】Ufml基因全长cDNA序列长714bp,包含261bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9．3ku,等电点pI为6．55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶c磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufml基因存在较高的同源性。【结论】Ufml基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufml基因功能及原核表达等奠定了基础。     

小麦细胞分裂素氧化/脱氢酶基因（TaCKX5）的克隆及其染色体定位

【目的】克隆小麦的TaCKX基因并对其序列进行生物信息学分析,明确TaCKX基因在小麦基因组中的分布情况,以期为今后深入研究小麦CKX基因以及利用该基因进行小麦重要农艺性状的遗传改良奠定基础。【方法】采用同源克隆结合BAC文库筛选的方法克隆基因,通过小麦缺体-四体对其进行染色体定位。【结果】从普通小麦中国春中分离得到TaCKX5基因的gDNA和cDNA序列。分析表明,TaCKX5基因的开放阅读框为1 596 bp,编码531个氨基酸,含有CKX基因家族典型的功能位点FAD-binding domain,预测属于分泌蛋白,并具有糖基化位点。使用中国春缺体-四体将TaCKX5定位于小麦第三同源群。系统发育分析表明,CKX基因在植物中较为保守,禾谷类作物中直向同源的CKX基因很可能具有相似的特性与功能。【结论】分离获得了普通小麦TaCKX5基因全长,TaCKX5分布于小麦染色体3A、3B、3D上,与水稻OsCKX5基因直向同源。     

版纳微型猪近交系AO血型A基因的克隆及生物信息学分析

【目的】扩增版纳微型猪近交系AO血型A基因编码区全长序列,并对序列进行生物信息学分析。【方法】提取版纳微型猪近交系猪组织的RNA,反转录成为cDNA,利用RT-PCR方法扩增AO血型A基因编码区全长序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并测定其序列,利用生物信息学方法分析其序列特征,并与其他12种物种构建系统进化树。【结果】版纳微型猪近交系AO血型A基因编码区全长1 095 bp,编码364个氨基酸,氨基酸序列与GenBank上登录的猪AO基因氨基酸序列相似性为99.5%。【结论】版纳微型猪近交系的AO血型A基因除了与黑猩猩、人和小鼠亲缘关系较远外,与牦牛、藏羚羊、水牛、小须鲸、绵羊、羊驼、野骆驼、山羊的关系都较为接近,其中与山羊的亲缘关系最为接近。     

独龙牛瘤胃细菌纤维素酶基因克隆

[目的]从分子生物学水平对独龙牛的瘤胃纤维素酶基因资源进行筛选及酶学特性研究,为后续开发利用新的纤维素酶提供参考依据,也为揭示瘤胃微生物降解纤维素的作用机理打下基础.[方法]提取独龙牛瘤胃微生物中的大片段基因组DNA,构建瘤胃微生物基因组文库,并进行纤维素酶活性筛选,筛选获得的高活性基因经测序后进行生物信息学分析与酶学性质研究.[结果]从独龙牛瘤胃中共获得20352个阳性克隆,白斑率达92%,构建的瘤胃微生物基因组文库容量899.6 Mb,空载率1.82%.从瘤胃微生物基因组文库筛选获得2个具有纤维素酶活性的阳性克隆(B1和B2),其中,B1基因序列长1230 bp,编码409个氨基酸,基因编码产物与来自Ruminococcusalbus纤维素酶基因编码产物(β-1,4-内切葡聚糖酶,GenBank登录号P23661.1)的覆盖率高达99%,其同源性高达97%;B2基因序列长1002 bp,编码333个氨基酸,基因编码产物与Unculturedmicroorganism纤维素酶基因编码产物(纤维糊精酶,GenBank登录号ADB80112.1)的覆盖率高达99%,其同源性为83%.B1和B2基因可在Rosetta原核表达宿主菌中成功诱导表达,B1纤维素酶的最适pH为6.0,最适温度40℃;B2纤维素酶的最适pH为6.0,最适温度40~50℃.[结论]从构建的独龙牛瘤胃微生物基因文库中筛选获得2株具有较高活力的纤维素酶(B1和B2),其中,B1为β-1,4-内切葡聚糖酶,而B2为新的纤维糊精酶,可为纤维素的体外降解提供新型材料.     

受PVY诱导的烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp的克隆与分析

【目的】通过筛选并克隆烟草抗马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)相关基因,分析其在不同诱导时间的相对表达量,揭示烟草抗病毒诱导的分子机理,以期为烟草抗病毒病育种奠定基础。【方法】通过抑制差减杂交和cDNA芯片从PVY诱导的抑制差减杂交文库中筛选上调表达(Ratio2)的基因中间片段,用RACE技术克隆其cDNA全长,并利用实时荧光定量PCR分析其在不同诱导时期的相对表达量。【结果】从受PVY诱导的烟草叶片中筛选一条595bp的基因中间片段并克隆得到一个全长为1770bp的天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp(GenBank登录号为GU144571),该基因编码506个氨基酸。多序列比对结果显示,该基因的编码产物与其它植物天冬氨酸蛋白酶家族成员具有高度的同源性,具有植物天冬氨酸蛋白酶典型的结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,Ntasp在PVY接种早期上调表达。【结论】克隆得到一个烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp,其表达受PVY侵染诱导。     

二斑叶螨乙酰辅酶A羧化酶基因全长cDNA克隆及其生物信息学分析

【目的】克隆二斑叶螨（Tetranychus urticae）的乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase,ACCase）基因,对其进行生物信息学分析并研究其在二斑叶螨敏感和抗性品系中的表达量。【方法】利用RT-PCR技术克隆ACCase基因的cDNA 全长,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性;利用实时荧光定量 PCR 方法分析ACCase基因在二斑叶螨敏感和抗螺螨酯品系中的表达差异。【结果】ACCase基因（GenBank 登录号：JX424763）的开放阅读框长度为7 068 bp, 编码2 235个氨基酸,分子量约为266.35 kD,理论等电点为6.38,包含典型的生物素羧化酶（biotin carboxylase,BC）、生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein,BCCP）和羧基转移酶（carboxyltransferase,CT）3个结构域。结合其它物种ACCase基因构建系统发育树表明,该基因与体虱（Pediculus humanus corporis）ACCase基因具有较高的同源性。实时荧光定量 PCR 结果表明,ACCase基因在抗螺螨酯品系中的相对表达量较高,与明感品系间存在显著差异。【结论】利用RT-PCR技术在二斑叶螨中克隆到ACCase基因,ACCase基因的过量表达可能与二斑叶螨对螺螨酯的抗性形成有关,为二斑叶螨的抗性治理提供了依据。     

控制桃粘/离核PG基因的BAC克隆筛选与序列分析

【目的】控制桃果实粘/离核性状的多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase,PG）基因存在串联重复和大片段的缺失。本研究对粘核桃所处的F-M基因座序列特征进行分析,为开发相关分子标记提供依据。【方法】本研究利用构建的粘核桃单株‘87-7-1’基因组的细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）文库,通过PCR筛选出含F-M基因座的阳性克隆,利用单分子纳米孔技术进行全长测序,并对BAC克隆中的插入片段进行基因注释、序列比对和生物信息学分析。【结果】利用已有桃品种的基因组重测序数据设计PCR引物,以BAC文库为模板,扩增F-M基因座上/下游稳定共有的序列,获得了扩增产物上/下游条带均为阳性的目标单克隆46-B-10。全长测序结果表明,BAC克隆的插入片段全长为111 612 bp,GC含量为37.03%。利用基因同源共线性方法对Prunus_persica_v2.0桃参考基因组和BAC克隆之间的同源信息进行比对分析,确定了同源区域。而与已知的桃参考基因组（测序品种为‘Lovell’,离核）序列进行比对,发现只有5个基因（Prupe.4G261700、Prupe.4G261800、Prupe.4G261900、Prupe.4G262000、Prupe.4G262500）序列能比对到该单克隆全长的区域,而‘87-7-1’在相应位置缺失了4个基因共34 kb,其中包括控制桃粘/离核的EndoPGF（Prupe.4G262200）。【结论】与桃参考基因组测序品种‘Lovell’相比,粘核桃单株‘87-7-1’的F-M基因座缺失了EndoPGF,只有EndoPGM,本研究明确了粘核桃F-M基因座的结构变异情况,为粘/离核性状分子标记的开发奠定了基础。     

棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组文库的构建

【目的】构建棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,为研究棉花线粒体基因组结构以及棉花细胞质雄性不育的形成机理提供基础。【方法】在借鉴其它作物的线粒体基因组BAC文库构建方法的基础上,对棉花线粒体DNA的提取及其BAC文库的构建进行探索和优化,构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,并采用同源克隆的方法克隆棉花线粒体的功能基因。【结果】构建的不育系和保持系的线粒体基因组文库分别包括2 600个克隆,插入DNA片段大小在10.3 kb和37.5 kb之间,平均分别为22.29 kb和21.36 kb。重组子的覆盖率分别达到棉花线粒体基因组的79倍和76倍。获得了3个棉花线粒体功能基因序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系的这3个基因序列无差异;以这3个基因为探针筛选文库,均获得阳性克隆。【结论】分别构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的BAC文库。获得了晋A不育系与其保持系的orfB,coxⅠ和nad4L 3个基因的全序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系在orfB、coxⅠ和nad4L基因全序列上无差异。     

蜡梅花cDNA文库构建及其高频出现脂转移蛋白cDNA的表达

【目的】构建蜡梅花cDNA文库，分析蜡梅脂转移蛋白基因的表达，为探索蜡梅冬季开花分子机理，分离克隆特色基因奠定基础。【方法】以蜡梅花器官为材料，用SMART cDNA Library Construction Kit 构建文库，RT-PCR分析基因表达。【结果】经测定原始文库滴度达到1.4×106 pfu/ml，扩增总文库滴度约为1010pfu/ml，重组率达到96%，插入片段在0.5 kb 以上，平均约1.1 kb，通过PCR 检测，从总文库中检测到了表达丰度不同的蜡梅PI、AP3和LTP基因的特异片段，说明所构建的文库覆盖度高、代表性强，LTP基因具有内含子，而总文库中扩增出的LTP基因不含内含子，说明所构建的cDNA文库无基因组DNA污染， LTP基因在蜡梅开花各个时期均表现较高的转录水平，与EST分析时高频率出现LTP序列的情况相符，证实所构建的文库能够反映蜡梅开花过程基因表达的基本情况。【结论】已获得高质量的蜡梅花cDNA文库，可以用于进一步的基因克隆或EST测序分析，这是首次正式报道蜡梅cDNA文库的构建。LTP基因在蜡梅开花过程中可能具有重要的生物学功能，为探索蜡梅冬季开花分子机理提供了线索。     

烟草抗马铃薯Y病毒病相关基因NtPsaN的克隆及表达分析

【目的】从高抗PVY烟草品种VAM中克隆抗病相关基因,分析该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在烟草抗PVY防御反应中的作用,为培育抗PVY烟草新品种奠定基础。【方法】利用SSH结合cDNA芯片筛选出来的病害诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆烟草抗病相关基因;生物信息学分析该基因保守结构域以及序列特征;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用实时荧光定量RT-PCR技术研究该基因的表达特性。【结果】克隆了1个烟草抗病相关基因,命名为NtPsaN,该基因具有PsaN基因家族保守结构域,OFR长度507bp,编码168个氨基酸;构建了PsaN亚基系统进化树;实时荧光定量RT-PCR结果显示接毒之后该基因表达与不接毒对照相比有明显上调趋势。【结论】克隆得到一个烟草PVY抗病相关基因NtPsaN,其表达受PVY侵染诱导,该基因可能在烟草抵御PVY病害侵染过程中起重要作用。     

Elymus wawawaiensis编码乙酰辅酶A羧化酶Acc-1基因序列的分析及系统学意义

质体乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化长链脂肪酸的合成。编码小麦质体ACCase的基因(Acc-1)已用于一年生小麦的系统与进化研究,但还未有多年生物种相应的研究报道。本研究发现,Elymus wawawaiensis的Acc-1基因第8外显子和第7内含子与其他已知该序列相比除核苷酸替代外,多了176个碱基,从而与现有已知的一年生小麦相应序列有显著差异。在NCBI中对该序列和已报道的Acc-1基因相应序列blast比对后,结果表明与Hordeum vulgare Acc-1具有87.15%的最高相似性。以Panicum virgatum、Zea mays和Lolim rigidum为外类群,最大简约法(MP)和邻接法(NJ)对该基因和已报道的Acc-1基因分别构建系统进化树,其中E.wawawaiensis和H.vulgare形成一个分支,自展支持率100%。研究同时表明该基因在小麦族多年生物种系统与进化研究中有重要的应用前景。     

梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库构建及互作蛋白的筛选

【目的】筛选与FWL1互作的蛋白,为研究FWL1基因调节果实大小机理提供依据。【方法】以杜梨、库尔勒香梨、鸭梨、早美香为材料,提取4个梨品种果实细胞分裂关键时期的果肉组织混样RNA。构建梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库,并鉴定文库质量。构建诱饵载体并转化酵母菌,筛选与FWL1互作的蛋白,对初步筛选出的阳性酵母克隆进行测序并在NCBI中进行Blast比对,确定候选互作蛋白。【结果】文库库容约为3×10⁷ CFU,大于1×10⁷ CFU,平均插入片段大于1 000 bp,阳性率为≥98%。诱饵载体无自激活功能,利用共转化方法,筛选出272个与FWL1互作的蛋白质。【结论】梨幼果膜系统酵母双杂交三框cDNA文库符合酵母双杂文库的基本条件,适用于后期筛选相互作用的蛋白。筛选出的272个互作蛋白在果实发育过程中表达不同,其中collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1和metallothionein-like protein可能与梨果实大小发育有关。