类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4调控芹菜不同组织的着色

【目的】 研究类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4在不同颜色芹菜中的基因型及相对表达量,结合类胡萝卜素含量测定,分析AgCCD4对芹菜组织中类胡萝卜素积累的影响,为进一步研究CCD亚家族基因在不同颜色芹菜组织着色中的作用奠定基础。【方法】 采用同源比对法检索芹菜基因组中的CCD家族基因AgCCD4。从‘津南实芹’‘黄太极’‘紫杆一号’和‘赛雪’4种不同颜色芹菜中分别克隆获得芹菜类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4。对芹菜AgCCD4的蛋白氨基酸序列组成、蛋白质理化性质、亲缘关系、空间结构等进行分析,预测其保守结构域和二级结构以及建立三级结构模型。采用荧光定量PCR技术检测AgCCD4在不同颜色芹菜不同组织中的表达水平。采用超高效液相色谱（UPLC）对4种颜色芹菜的叶片、叶柄和根中叶黄素和β-胡萝卜素的含量进行测定。采用农杆菌介导的瞬时表达转化法,研究AgCCD4蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。【结果】 序列分析结果表明AgCCD4包含1个长度为1 779 bp的开放阅读框（ORF）,编码592个氨基酸。‘赛雪’中AgCCD4的核苷酸序列与其他品种相比存在18个碱基和9个氨基酸位点的差异,蛋白质相对分子质量分别为65.07 kD和65.12 kD,等电点分别为6.03和5.95。进化树分析表明,芹菜AgCCD4与菊科的向日葵和莴苣CCD4进化关系较近。AgCCD4蛋白的二级结构中包含多个α-螺旋和无规则卷曲,三级结构主要以β-折叠为主。亚细胞定位分析表明AgCCD4是一个定位在叶绿体上的蛋白。对4种颜色芹菜叶片、叶柄和根中叶黄素和β-胡萝卜素的含量进行测定,结果显示芹菜根中均未检测到叶黄素和β-胡萝卜素,叶片中叶黄素和β-胡萝卜素含量均以‘津南实芹’最高,分别为1 102.58 μg∙g^-1 DW和241.92 μg∙g^-1 DW,‘紫杆一号’最低,分别为57.12 μg∙g^-1 DW和45.65 μg∙g^-1 DW。在叶柄中,仅在‘黄太极’中检测到β-胡萝卜素,叶黄素也只在‘津南实芹’和‘黄太极’中被检测到。荧光定量PCR结果显示,AgCCD4在芹菜叶片中表达量最高,在根中最低。‘紫杆一号’和‘赛雪’叶片中AgCCD4的相对表达量相似,都显著高于‘津南实芹’和‘黄太极’。【结论】 本研究从4种颜色芹菜中分别克隆得到AgCCD4,其中‘赛雪’的基因序列和其他品种存在差异,其蛋白均含有RPE65保守结构域。AgCCD4表达量在芹菜不同组织中具有显著差异。芹菜中AgCCD4表达量与类胡萝卜素含量呈负相关。植物体中类胡萝卜素的含量和种类影响植株的颜色变化,AgCCD4可能通过降解类胡萝卜素来调控芹菜组织着色。     

梅PmARF17克隆及其在花发育中与内源激素的调控模式

【目的】分析梅PmARF17的生物学功能,探究梅花发育进程中其表达丰度与内源激素动态变化的关系,为梅花发育的调控研究提供依据。【方法】以梅品种‘大嵌蒂’为试材,克隆PmARF17,利用生物信息学软件分析基因结构、系统进化及其与其他物种同源蛋白的差异;亚细胞定位确定PmARF17蛋白在细胞中作用的部位;以梅品种‘大嵌蒂’和‘龙眼’不同发育阶段的花芽、叶芽、花器官为试材,利用qRT-PCR检测PmARF17时空表达模式,通过UPLC法测定IAA、GA₃、ABA、ZT含量的动态变化,并与PmARF17的表达进行相关性分析;克隆PmARF17启动子,分析启动子的顺式作用元件,利用瞬时表达解析PmARF17与GA₃的调控模式。【结果】从梅品种‘大嵌蒂’中克隆得到PmARF17,系统进化树分析表明PmARF17蛋白与其他植物的ARF蛋白序列高度同源;亚细胞定位表明其作用于细胞核和细胞膜上;qRT-PCR表达和内源激素含量的相关性分析表明,PmARF17的表达与IAA含量的变化趋势没有明显的相关性。PmARF17在雌蕊完好花芽中的表达水平相对不完全花芽显著上调,而GA₃含量与PmARF17的表达趋势一致。ABA和ZT含量总体上与PmARF17的表达呈相反的趋势,表明两者可能抑制PmARF17的表达。PmARF17启动子含有GA顺式元件,且具有启动活性和组织表达特异性,在花瓣、雄蕊及根部特异表达。【结论】 PmARF17可能是梅花发育的正调控基因,促进梅雌蕊的正常发育。PmARF17的表达可能受到GA₃的正调控,其可能通过作用于雄蕊和花瓣,进而影响梅的雌蕊发育进程。     

‘红地球’葡萄花芽分化过程中的转录组分析

【目的】 葡萄是我国重要的果树树种,花芽分化直接影响葡萄的质量和数量。对‘红地球’葡萄花芽分化过程中的花芽进行比较分析,探索‘红地球’葡萄花芽分化机制,挖掘关键基因,为了解‘红地球’葡萄花芽分化提供理论基础。【方法】 对‘红地球’葡萄花芽分化过程中4个发育阶段：S1（未分化期）、S2（花原始体发育期）、S3（花序主轴发育期）和S4（花序二级轴发育期）的芽进行形态学观察和植物激素测定,并进行转录组测序分析及验证。【结果】 ‘红地球’葡萄花芽分化过程中共发现13 729个差异基因,其中S1-S2、S2-S3、S3-S4和S1-S4分别有4 158、2 050、3 425和7 652个差异基因。在S1-S4差异基因的富集调控网络中发现差异基因在激素介导的信号通路、脱落酸代谢过程、对酸性化学物质的反应和植物细胞壁组织或生物发生等通路富集。在激素介导的信号通路中发现大量与生长素、赤霉素和脱落酸等相关基因,测定表明,生长素在S2时期含量最高,而在S3和S4时期含量最低;赤霉素含量在花芽分化过程中不断降低,在S4时期为S1时期的80%;脱落酸含量在S1和S4时期较高,而在S2时期最低。此外,S1-S4差异基因来自转录因子家族（MYB、ERF、bHLH和MADS-box等）,表明这些转录因子家族基因参与了‘红地球’葡萄花芽分化。对差异表达的13个MADS-box家族基因进一步分析表明,MADS8、AGL65、AGL15、AGL12和MADS2在花芽分化进程中表达上调,而AGL30、LeMADS、FBP24、AGL14和MADS3表达下调。对这些MADS-box基因进行qRT-PCR验证,基因表达趋势与转录组数据一致且相关系数较高,表明数据分析结果可靠。【结论】 ‘红地球’葡萄花芽分化是一个复杂的生物过程,其中,植物激素介导的信号通路以及MADS-box家族基因在花芽分化中发挥重要作用。研究结果提供了一个关于转录因子、基因和激素的信息,有助于揭开这一复杂的发育过程,并为‘红地球’葡萄花芽分化综合模型的建立提供理论基础。     

甜瓜幼果果皮颜色基因GR的精细定位

【目的】 探究甜瓜幼果果皮颜色性状的遗传规律,精细定位目标性状基因GR,加深对甜瓜发育过程中果皮颜色转变的认知,为开展甜瓜果皮颜色的分子设计育种奠定基础。【方法】 以幼果深绿皮的薄皮甜瓜纯系‘MR-1’和幼果浅绿皮的厚皮甜瓜纯系‘LGR’为亲本,构建F₁正反交群体;以及利用F₁与浅绿皮亲本‘LGR’杂交构建BC₁F₁回交群体,对甜瓜幼果果皮颜色基因GR（Green Rind）进行遗传分析。选取BC₁F₁群体中深绿皮和浅绿皮单株各20株,混池其DNA进行BSA-seq以获取GR初定位区间。基于‘MR-1’和‘LGR’两亲本的重测序数据,开发初定位区段内特异性较好的分子标记,鉴定筛选扩大群体（BC₁F₁和F₂）中的重组交换单株,验证和缩小定位区间,实现GR精细定位。将两亲本定位区段内注释基因的编码区进行测序以确定候选基因和关键变异位点。通过调查BC₁F₁回交群体中幼果果皮颜色和成熟果果皮颜色,利用相关性分析探究果皮颜色转变在甜瓜发育过程中的内在联系。【结果】 通过分析F₁群体果皮颜色发现所有F₁单株幼果都表现为深绿皮。另外,BC₁F₁群体单株幼果果皮颜色会发生分离,其中深绿皮单株数﹕浅绿皮单株数约等于1﹕1,以及F₂群体中深绿皮植株与浅绿皮植株的分离比为3﹕1。这些分离比都符合孟德尔遗传定律,表明幼果果皮颜色是受单个核基因GR控制的质量性状,并且深绿对浅绿为显性。通过BSA-seq分析将基因初步定位于4号染色体长臂,物理距离为1.8 Mb的范围内。利用开发的分子标记在扩大的定位群体中共筛选到24个重组交换单株。经过后代基因型和表型验证,最终将GR精细定位在标记4-102和4-81之间约17.7 kb的范围内,区段内共包含4个注释基因。经测序分析发现一个编码GLKs类转录因子CmAPRR2的基因MELO3C003375在亲本‘MR-1’和‘LGR’中存在多处变异,其中有3处发生了同义突变,1处错义突变和1处无义突变。无义突变出现在MELO3C003375的编码区第856位碱基处（由G变成T）,导致亲本‘LGR’中蛋白翻译提前终止,其Myb-DNA结合结构域大部分缺失,推测基因MELO3C003375（CmAPRR2）即为影响甜瓜幼果果皮颜色的基因,而第856位的单碱基替换造成的无义突变即为关键变异位点。此外,BC₁F₁回交群体单株的表型调查结果显示幼果与成熟果的果皮颜色之间存在显著相关性。【结论】 甜瓜幼果果皮颜色（深绿/浅绿）性状为质量性状,受单个核基因GR控制。通过遗传定位手段推断MELO3C003375（CmAPRR2）为最有可能影响甜瓜幼果果皮颜色的候选基因。     

低温对甘薯淀粉理化特性及代谢关键基因表达量的影响

【目的】淀粉是甘薯块根的主要组成成分,淀粉理化特性直接决定着甘薯的主要用途;同时,甘薯是较为典型的喜温作物,对储藏温度较为敏感。因此,研究低温对淀粉理化特性的影响,为甘薯安全储藏提供参考。【方法】本研究以‘烟薯25’和‘商薯19’为试验材料,设置适温（13℃,CK）和低温（4℃）储藏14 d,分析甘薯块根淀粉粒径大小与分布、热焓特性、糊化特性、吸湿性及膨胀力等特征指标的差异。【结果】不同甘薯品种的直链/支链淀粉含量存在显著差异,‘商薯19’的直链淀粉含量（31.47%）显著高于‘烟薯25’（25.86%）,支链淀粉则完全相反;‘烟薯25’和‘商薯19’的平均粒径、体积和表面积均分别分布于≤2.50 μm、2.50—5.00 μm和5.00—25.00 μm三个区间,低温胁迫使二者的淀粉颗粒平均粒径降低,体积和表面积减小,吸湿性和膨胀力降低;‘烟薯25’和‘商薯19’薯块淀粉在糊化过程中的起始温度（T₀）、峰值温度（Tp）和热晗值（△H）与CK相比均显著下降,其中,‘烟薯25’的△H变化幅度高于‘商薯19’,表明低温对‘烟薯25’淀粉热特性的影响程度高于‘商薯19’;低温储藏条件下,‘烟薯25’和‘商薯19’的最高黏度（PKV）、崩解值（BDV）和回复值（CSV）均显著下降,糊化温度（PT）受低温的影响不显著,但品种间差异显著;低温下,基因IbAGPa（ADP-葡萄糖焦磷酸化酶）、IbAGPb、IbSBEI（淀粉分支酶）和IbSBEII的表达量均显著下降,而Ibα-amylase（淀粉水解酶）和Ibβ-amylase则显著上升。【结论】温度是影响甘薯淀粉理化品质的重要因素,甘薯块根淀粉理化特性变化与甘薯储藏温度密切相关。     

高茶氨酸茶树新品系‘福黄1号’黄化变异机理

【目的】分析茶树黄化变异相关的代谢和转录机制,探究高茶氨酸茶树新品系‘福黄1号’的黄化变异和高茶氨酸形成机理。【方法】以茶树‘福安大白茶’及其黄化突变种质‘福黄1号’为试验材料,利用超微电镜、广泛靶向代谢组学、靶向代谢组学及转录组学联合分析,确定茶树黄化变异相关的色素、代谢物及转录组数据。【结果】超微结构显示,‘福黄1号’的叶绿体类囊体呈现丝状,基粒片层排列散乱不规则,片层间疏松,存在许多异常的囊泡。色素含量测定表明,叶绿素a和叶绿素b含量显著下降,叶绿素a/b比率下降,相关基因SGR表达显著下调,黄化叶片中光捕获叶绿素a/b蛋白（LHC）表达显著下调。类胡萝卜素总含量虽然差异不大,但各组分含量显著变化,玉米黄质为唯一显著增加的组分,其调控基因VDE表达显著上调,其余组分含量均下降。与‘福安大白茶’相比,‘福黄1号’中共鉴定到680个差异表达基因（DEGs）和57个显著变化的代谢物（SCMs）。KEGG富集分析表明,SCMs和DEGs显著富集到氨基酸生物合成、谷胱甘肽代谢以及TCA循环等途径。此外,与碳和氮代谢相关的通路也被激活。通过靶向测定,共鉴定到19种游离氨基酸,新品系‘福黄1号’游离氨基酸含量显著高于‘福安大白茶’,达到97.13 mg∙g^-1,其中茶氨酸为66.90 mg∙g^-1,占氨基酸含量的68.89%,而精氨酸含量达到8.46 mg∙g^-1,是‘福安大白茶’的56.4倍。调控氨基酸合成的GOGAT和GLU的表达量上调1.17倍和3.17倍。【结论】‘福黄1号’的芽叶色泽主要受叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮等色素代谢的影响,SGR和4种LHCs的共同作用也可能影响叶绿体的生物合成来调节叶片色泽。‘福黄1号’茶氨酸含量显著高于‘福安大白茶’的原因主要是泛素化相关的蛋白质水解酶表达上调蛋白降解能力加强,叶绿素和其他含氮分子生物合成的减少,以及黄化叶中碳骨架的缺乏,氨基和氮资源被更有效地储存,使得与氨基酸合成相关的氮代谢激活,茶氨酸合成前体物质之一的谷氨酸积累,这可能促使茶氨酸成为黄化叶中显著积累的含氮化合物。     

不同类型桃果实内酯芳香物质构成与重要性评价

【目的】分析不同类型成熟桃果实的内酯芳香物质构成,并评价其对于桃果实芳香的重要性。【方法】以涵盖不同果肉质地、果肉颜色、果实成熟期等的多品种桃果实为试材,采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用体系检测样品的芳香物质,通过精确的定性和定量分析,明确内酯芳香物质的构成,并结合芳香物质的气味活性值分析评价其重要性。【结果】内酯芳香物质存在于本研究全部桃品种的成熟果实中,样品中共检测到10种内酯芳香物质,包括γ-己内酯、γ-辛内酯、γ-庚内酯、γ-癸内酯、5-羟基-2, 4-癸二烯酸-δ-内酯、δ-癸内酯、γ-十一内酯、δ-辛内酯、茉莉内酯、顺式-4-羟基-6-十二烯酸内酯。各内酯物质具有特定的气味属性,主要散发果香（桃/椰子）、甜香、奶油香、焦糖香、花香和草本味等气味。不同品种的桃果实共有的内酯物质是γ-己内酯,较为普遍存在的内酯物质包括γ-癸内酯和δ-癸内酯,部分品种存在特有的内酯物质,如‘深州蜜桃’果实中的顺式-4-羟基-6-十二烯酸内酯。果实成熟期时,溶质‘白花水蜜’‘深州蜜桃’‘橙香’‘奉化玉露（晚）’‘肥城红里大桃’等品种中检测到较多种类的内酯芳香物质,硬质‘霞脆’‘秦王’‘华玉’等品种果实具有较少种类的内酯芳香物质。气味活性值分析表明,由于极低的气味阈值和较高的物质含量,γ-癸内酯存在于大部分品种中,且对于这些品种桃香气的形成具有重要贡献,使溶质‘深州蜜桃’‘橙香’‘奉化玉露（晚）’‘白花水蜜’等品种果实均具有较为强烈的典型的桃香气味,溶质‘阿初桃’和硬质‘华玉’品种的典型桃果芳香较淡,而未检测到该内酯的硬质‘秦王’‘霞脆’品种果实则没有典型的桃果芳香。此外,γ-辛内酯使部分品种（本研究中为‘橙香’和‘深州蜜桃’）桃果实呈现更为强烈的椰果味和非常甜的气味。【结论】内酯是桃果实挥发性芳香物质的一个重要类别,桃果实内酯物质构成丰富,成熟果实至少包含10种内酯芳香物质。内酯物质类别和含量的差异是不同品种尤其是不同果肉质地的桃果实芳香特征的一个重要体现,而不同果肉颜色或成熟期品种的内酯芳香无显著差异。γ-己内酯是品种之间共有的内酯物质,γ-癸内酯和δ-癸内酯是品种之间较为普遍存在的内酯,顺式-4-羟基-6-十二烯酸内酯等是部分品种特有的内酯物质。γ-癸内酯和γ-辛内酯等内酯对于品种的典型桃香气以及独特芳香气味的形成具有重要贡献。     

不同砧木对欧亚种葡萄‘丹娜’果实类黄酮物质的影响

【目的】类黄酮物质是酿酒葡萄的重要代谢产物,对葡萄果实及其葡萄酒的品质有重要影响。研究不同砧木对‘丹娜’（Vitis vinifera L. cv. Tannat）葡萄基本理化指标和类黄酮物质的影响,为砧木的选择利用提供理论依据。【方法】以‘丹娜’葡萄新梢为接穗,绿枝嫁接‘1103P’‘101-14’‘SO4’和‘贝达’（‘Beta’）等4种不同砧木,在分析不同嫁接苗商业采收期（2016、2017和2019年）葡萄果实基本理化指标（可溶性固形物、可滴定酸、pH、百粒重）的基础上,利用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术,检测‘丹娜’葡萄不同砧穗组合和自根苗的类黄酮物质组成和含量。【结果】砧木对‘丹娜’葡萄果实百粒重影响较小,自根苗和‘101-14’嫁接的‘丹娜’葡萄可溶性固形物较高;Tannat/1103P、Tannat/101-14和Tannat/Beta组合果汁可滴定酸浓度高于自根苗;Tannat/SO4组合的花色苷和黄酮醇含量最低,Tannat/101-14组合与自根苗花色苷和黄酮醇含量较高;Tannat/101-14组合果皮中的黄烷醇含量较高,Tannat/1103P组合果皮中花色苷、黄酮醇含量较低,但黄烷醇含量较高。通过OPLS-DA模型,发现与自根苗相比,Tannat/101-14组合差异化合物主要是二甲花翠素类花色苷;Tannat/Beta组合主要差异化合物为二甲花翠素类、花翠素类和乙酰化类花色苷、槲皮素类黄酮醇以及总黄烷醇;而Tannat/SO4组合与自根苗差异化合物二甲花翠素类、花翠素类、花青素类和乙酰化类花色苷及槲皮素类黄酮醇;Tannat/1103P组合的差异化合物则主要为乙酰化类和二甲花翠素类花色苷、槲皮素类黄酮醇。【结论】在北京地区,4种砧木嫁接都有降低‘丹娜’葡萄果实中甲基花青素类、甲基花翠素类、花青素类、非酰化类、乙酰化类、香豆酰化类花色苷以及梅酮类和西伯利亚落叶松黄酮类黄酮醇物质的趋势。‘101-14’嫁接的‘丹娜’葡萄果皮中花色苷、黄酮醇、黄烷醇等类黄酮物质积累较多,有利于酿酒品质的提升,推荐使用;而‘SO4’嫁接的‘丹娜’葡萄类黄酮物质积累较少,不推荐使用。     

黄瓜叶酸合成关键基因克隆与分析

【目的】分析黄瓜基因组中与叶酸合成代谢相关的基因数量、定位以及表达特征,对关键酶基因进行生物信息学分析与克隆,旨在为黄瓜叶酸合成调控研究奠定基础。【方法】根据已报道的拟南芥叶酸合成相关基因,利用黄瓜基因组数据库中9930_V3版本进行BLAST比对。利用MapChart绘制黄瓜染色体物理图谱并对基因定位。利用qRT-PCR分析这些基因在黄瓜果实发育不同时期和不同材料中的表达量。通过MEGA、WebLOGO、ExPASy等工具对关键酶基因进行生物信息学分析。通过PCR扩增对关键酶基因进行克隆,并测序分析基因的序列差异。【结果】同源比对获得19个黄瓜叶酸代谢相关基因,这些基因不均匀分布在黄瓜7条染色体上,且以Chr.4和Chr.5上分布最多。通过对其中11个调控叶酸合成的基因在测序黄瓜9930果实发育不同时期以及果实叶酸含量高低差异显著的2份材料的表达量分析,发现CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS和CsDHNA 3个基因与果实叶酸含量变化趋势完全一致;CsADCS、CsADCL、CsDHNA、CsHPPK/CsDHFS、CsFPGS、CsDHFS等基因的表达量在2份材料中具有显著差异。通过对2个调控叶酸合成限速步骤的关键酶基因CsGCHI和CsADCS的蛋白序列及蛋白结构域分析,发现各物种中CsGCHI的同源基因均具有2个GTP_cyclohydroI结构域;CsADCS的同源基因均具有2个GATase结构域、1个Anth_synt_I_N结构域和1个Chorismate_bind结构域。它们在不同物种中高度保守,进化树分析亲缘关系近的物种聚类到一起。分别扩增黄瓜果实低叶酸含量自交系65G和高叶酸含量自交系02245中CsGCHI和CsADCS的同源基因,序列分析表明CsaV3_1G041250全长为3 012 bp,CDS序列长度为1 413 bp,3个SNP位点的突变导致了氨基酸序列的变异;CsaV3_7G026240全长为3 047 bp,CDS长度1 407 bp,序列无变异;CsaV3_5G036360全长7 941 bp,CDS序列长度为2 706 bp,序列无变异。【结论】鉴定出19个不均匀分布在7条染色体上的黄瓜叶酸代谢相关基因,基因CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS 、CsDHNA和CsADCS是影响黄瓜果实叶酸含量变化、导致叶酸含量高低显著差异的关键基因,调控叶酸合成限速步骤的关键酶基因GCHI及ADCS功能相对保守,CsGCHI在65G、02245中有3个SNP位点的突变导致了氨基酸序列的差异。     

溶质和硬质型桃果实成熟过程果肉多肽组学分析

【目的】 比较溶质型和硬质型桃在果实成熟过程中肽段和前体蛋白的差异,为挖掘决定或调控成熟过程的关键多肽提供理论依据。【方法】 通过多肽组学的方法,对溶质型（‘CN13’）和硬质型（‘CN16’）桃内源性多肽特征以及前体蛋白功能进行分析,对比两种肉质桃果实在成熟衰老过程中前体蛋白和多肽的相对含量,并对差异肽段前体蛋白进行富集分析。【结果】 本研究分别提取了‘CN13’和‘CN16’两个时期（S3和S4III）的内源性肽样品进行质谱检测,共鉴定到473个前体蛋白,包含特异性肽段序列2 580条。对肽段的分子量、等电点以及剪切位点进行归纳整理,并对内源性肽段所对应的高丰度前体蛋白进行COG功能注释和pathway富集分析,结果显示前体蛋白主要参与一般功能预测、翻译后修饰、蛋白质转换、能量产生和转换以及碳水化合物运输与代谢等过程。差异肽段前体蛋白的富集分析表明,‘CN13’在成熟过程中差异肽段前体蛋白与氧化还原、活性氧代谢和电子传递链等生物学过程相关,主要参与糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径和RNA转运等途径;而‘CN16’差异肽段前体蛋白是与金属离子反应、无机物反应和镉离子反应等生物学过程相关,主要参与多种环境下微生物新陈代谢、剪接体和RNA转运等途径;同处在S4III时期的‘CN16’和‘CN13’差异肽段前体蛋白与基因表达、翻译和细胞大分子生物学过程相关,主要参与RNA降解、RNA转运和剪接体等途径。【结论】 ‘CN13’和‘CN16’果实在成熟过程中多肽差异显著,差异肽段前体蛋白主要涉及淀粉/蔗糖代谢、糖酵解和核糖体合成等途径,暗示这些代谢途径与桃果实成熟衰老关系密切,为进一步挖掘调控桃果实成熟衰老过程的关键多肽提供了理论参考。     

琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选

【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。     

奶牛瘤胃微生物BAC文库中ACCase基因的筛选与生物信息学分析

 【目的】从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选含乙酰CoA羧化酶(ACCase)基因的克隆子,并对其全长测序和生物信息学分析。【方法】利用PCR序列驱动筛选法,从瘤胃微生物BAC文库中筛选ACCase基因,鸟枪法测定基因序列后,进行基因注释、比对和系统发育分析。【结果】筛选得到了含ACCase基因的克隆(U12),其插入片段序列(URE12)全长43 358 bp,GC含量为43.75%,经GeneMark程序预测含有38个基因,经Signature程序预测属于变形菌门。ACCase基因(Acc-32)编码159个氨基酸,与Elusimicrobium minutum的ACCase基因具有41%的相似度,编码蛋白分子量为17.89 kD,等电点为5.27,在距离Acc-32上游的33 kb区域,发现一段能编码ACCase连接酶的基因。Acc-32的结合位点氨基酸残基为GQVICVIEAMKVFNELKA,系统发育分析表明Acc-32属于ε-变形菌纲。【结论】得到了含有ACCase基因的序列片段,并且ACCase基因具有新的结构特征。     

榅桲4CL基因的克隆与生物信息学分析

【目的】克隆榅桲果肉(Cydonia oblonga Mill)中4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL)基因,研究其序列特征,为该基因在榅桲果实发育过程中的作用和功能奠定基础。【方法】以榅桲果肉为试材,基于GenBank报道的近缘物种4CL基因cDNA序列,应用Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物。提取榅桲总RNA,经反转录后合成cDNA,应用RT-PCR方法成功扩增出4CL基因片段并克隆到pMD18-T载体。通过DNAstar软件进行同源序列比对,ClustalX结合MEGA4.1软件构建系统进化树,采用Protparam在线程序分析蛋白质的理化性质,用DNAstar的Protean程序预测二级结构。【结果】榅桲4CL基因其开放阅读框(ORF)序列为1 710 bp,编码570个氨基酸,蛋白分子质量为68.4 kD,与其他物种序列同源性最高达91.99%,进化关系上与水密桃较近;榅桲4CL蛋白为亲水性蛋白,二级结构中以无规卷曲(Random coil)为主,占比达到44.27%。【结论】获得了榅桲4CL基因全长编码区序列,探明了该序列的结构特征。     

桃若干重要性状的KASP分子标记开发与应用

【目的】 开发一系列高通量、低成本的桃重要性状竞争性等位基因特异PCR（Kompetitive Allele Specific PCR,KASP）标记,包括果皮有毛/无毛、果形扁平/圆形、果肉硬质/非硬质、DBF（Dominant Blood Flesh）红肉/非红肉、抗/感蚜等5对性状,加速桃优良品种培育,缩短桃育种年限。【方法】 本研究在控制这些性状的候选基因及位点附近300 kb内,利用已有桃种质资源的基因组序列比对,开发KASP标记,对已知表型的桃种质材料进行基因分型验证,最终获得与目标性状紧密连锁的KASP标记。【结果】 利用开发的5个性状的KASP分子标记对桃杂交分离群体和自然群体进行基因型检测,结果表明,标记鉴定结果与已知表型完全一致,准确率为100%。其中,杂交群体中果皮有毛/无毛性状分离比例为30﹕30,果形扁平/圆形分离比例为31﹕29,果实硬质/非硬质分离比例为27﹕26,抗蚜/感蚜分离比例为49﹕46,均符合孟德尔遗传1﹕1的分离定律。【结论】 开发的KASP标记可高效检测桃果实外观、抗性、肉质等重要性状相关基因的等位变异,在基因型鉴定、亲本选配和杂种后代的分子标记辅助选择中有很好的应用前景。     

‘湖景蜜露’桃果实酰基辅酶A氧化酶编码基因的克隆及表达分析

【目的】根据国际桃基因组序列信息,进行克隆和表达分析与桃果实内酯类合成相关的果肉组织酰基辅酶A氧化酶(Acyl-CoA oxidase,ACX)的5个候选基因,为进一步开展桃香气物质代谢分子机理的研究提供新的研究方向。【方法】根据Phytozome(www.phytozome.org/peach)发布的桃ACX全基因组序列设计特异引物对5个基因全长进行克隆测序,与参考编码序列进行比对和编码蛋白性质进行分析,并对这些成员进行组织特异性表达分析。【结果】获得了桃果肉组织中表达的5个ACX编码基因全长序列,PpACX1、PpACX3的CDS区没有突变,PpACX2核苷酸序列871位处A突变为G,导致氨基酸序列中谷氨酰胺变异为精氨酸;PpACX4的核苷酸序列在80位和368位存在两处同义突变;PpACX5在475位处A突变为C,导致蛋氨酸突变为亮氨酸。同源性分析结果显示,这些基因的氨基酸序列与番茄、南瓜、大麦、葡萄等高等植物的氨基酸序列同源性很高。系统进化树分析表明,5个基因家族成员中,除PpACX4外其余4个成员处在同一个进化分支上,且与南瓜、葡萄、番茄、大豆等的亲缘关系较近。在根、茎、叶、果实表达证明,PpACX1是果实中主要大量表达成员。【结论】‘湖景蜜露’桃果实中表达的5个桃ACX编码基因全长与基因组数据数据库有一定差异,PpACX1为5个成员中较为关键的基因成员。     

棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组文库的构建

【目的】构建棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,为研究棉花线粒体基因组结构以及棉花细胞质雄性不育的形成机理提供基础。【方法】在借鉴其它作物的线粒体基因组BAC文库构建方法的基础上,对棉花线粒体DNA的提取及其BAC文库的构建进行探索和优化,构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,并采用同源克隆的方法克隆棉花线粒体的功能基因。【结果】构建的不育系和保持系的线粒体基因组文库分别包括2 600个克隆,插入DNA片段大小在10.3 kb和37.5 kb之间,平均分别为22.29 kb和21.36 kb。重组子的覆盖率分别达到棉花线粒体基因组的79倍和76倍。获得了3个棉花线粒体功能基因序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系的这3个基因序列无差异;以这3个基因为探针筛选文库,均获得阳性克隆。【结论】分别构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的BAC文库。获得了晋A不育系与其保持系的orfB,coxⅠ和nad4L 3个基因的全序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系在orfB、coxⅠ和nad4L基因全序列上无差异。     

九仙蜜桃室温贮藏过程中果实品质及抗氧化酶系统的变化

以九仙蜜桃的离核和粘核两品系为材料,研究其在室温贮藏过程中果实硬度、果实腐烂率、果皮颜色、果皮中叶绿素和类胡萝卜素含量、果实品质、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶( SOD)、过氧化物酶( POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化.结果表明,在贮藏第12天,离核果实硬度为粘核果实的45.28%;果实腐烂率比粘核高51%;果实中可溶性固形物含量离核和粘核分别增加了35.1%和30.8%;总糖含量离核增加了38.6%,粘核增加了30.0%,而可滴定酸含量整体呈下降趋势.果实中MDA含量离核和粘核分别比贮藏初期增加了60.6%和25.1%,与离核果实相比,粘核果实SOD、POD、CAT活性的高峰期出现较迟,并在贮藏后期保持了较高的活性,从而提高了其耐贮性.     

广泛靶向代谢组学解析桃蚜危害对桃树次生代谢产物的影响

[目的]阐明桃蚜(Myzus persicae)危害条件下桃树抗蚜和感蚜品种的代谢响应机制,并确定桃树响应桃蚜危害过程中起关键作用的次生代谢产物.[方法]采用抗蚜和感蚜桃树幼嫩新梢进行桃蚜危害处理,取接种3 d的桃树新梢进行次生代谢产物提取,并利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)对抗蚜品种(品系)'96-...     

大麦BAC文库三维混合池的构建与HvGW2筛选

【目的】从大麦BAC文库中快速筛选包含目的基因HvGW2的阳性BAC克隆。【方法】构建BAC文库三维混合池,设计2对HvGW2特异性引物,进行BAC文库筛选,对含有目的基因HvGW2的阳性BAC克隆进行测序,获得编码大麦GW2蛋白的基因组DNA序列,并与禾本科中的GW2进行同源进化分析。【结果】构建了大麦BAC文库的三维混合池160个,文库空载率为0.18%;筛选到含HvGW2的阳性BAC克隆3个,其中,BAC克隆196M02包含完整编码该基因的序列;HvGW2包含8个外显子和7个内含子,具有与其它植物GW2相似的结构特征和保守的功能结构域;同源进化分析结果显示,大麦与小麦的GW2蛋白同源性最高;序列分析发现,HvGW2第6内含子上包含2个不同类型的反转录转座子插入,从而使大麦比其它作物的GW2长度增加11.5 kb以上。【结论】通过构建三维混合池快速筛选包含目的基因的单个阳性BAC克隆,建立了大麦目标基因克隆的辅助平台;HvGW2基因组中位于内含子区的反转录转座子插入导致基因长度增加,可能是影响该基因转录水平的关键变异。