类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4调控芹菜不同组织的着色

【目的】 研究类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4在不同颜色芹菜中的基因型及相对表达量,结合类胡萝卜素含量测定,分析AgCCD4对芹菜组织中类胡萝卜素积累的影响,为进一步研究CCD亚家族基因在不同颜色芹菜组织着色中的作用奠定基础。【方法】 采用同源比对法检索芹菜基因组中的CCD家族基因AgCCD4。从‘津南实芹’‘黄太极’‘紫杆一号’和‘赛雪’4种不同颜色芹菜中分别克隆获得芹菜类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4。对芹菜AgCCD4的蛋白氨基酸序列组成、蛋白质理化性质、亲缘关系、空间结构等进行分析,预测其保守结构域和二级结构以及建立三级结构模型。采用荧光定量PCR技术检测AgCCD4在不同颜色芹菜不同组织中的表达水平。采用超高效液相色谱（UPLC）对4种颜色芹菜的叶片、叶柄和根中叶黄素和β-胡萝卜素的含量进行测定。采用农杆菌介导的瞬时表达转化法,研究AgCCD4蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。【结果】 序列分析结果表明AgCCD4包含1个长度为1 779 bp的开放阅读框（ORF）,编码592个氨基酸。‘赛雪’中AgCCD4的核苷酸序列与其他品种相比存在18个碱基和9个氨基酸位点的差异,蛋白质相对分子质量分别为65.07 kD和65.12 kD,等电点分别为6.03和5.95。进化树分析表明,芹菜AgCCD4与菊科的向日葵和莴苣CCD4进化关系较近。AgCCD4蛋白的二级结构中包含多个α-螺旋和无规则卷曲,三级结构主要以β-折叠为主。亚细胞定位分析表明AgCCD4是一个定位在叶绿体上的蛋白。对4种颜色芹菜叶片、叶柄和根中叶黄素和β-胡萝卜素的含量进行测定,结果显示芹菜根中均未检测到叶黄素和β-胡萝卜素,叶片中叶黄素和β-胡萝卜素含量均以‘津南实芹’最高,分别为1 102.58 μg∙g^-1 DW和241.92 μg∙g^-1 DW,‘紫杆一号’最低,分别为57.12 μg∙g^-1 DW和45.65 μg∙g^-1 DW。在叶柄中,仅在‘黄太极’中检测到β-胡萝卜素,叶黄素也只在‘津南实芹’和‘黄太极’中被检测到。荧光定量PCR结果显示,AgCCD4在芹菜叶片中表达量最高,在根中最低。‘紫杆一号’和‘赛雪’叶片中AgCCD4的相对表达量相似,都显著高于‘津南实芹’和‘黄太极’。【结论】 本研究从4种颜色芹菜中分别克隆得到AgCCD4,其中‘赛雪’的基因序列和其他品种存在差异,其蛋白均含有RPE65保守结构域。AgCCD4表达量在芹菜不同组织中具有显著差异。芹菜中AgCCD4表达量与类胡萝卜素含量呈负相关。植物体中类胡萝卜素的含量和种类影响植株的颜色变化,AgCCD4可能通过降解类胡萝卜素来调控芹菜组织着色。     

高茶氨酸茶树新品系‘福黄1号’黄化变异机理

【目的】分析茶树黄化变异相关的代谢和转录机制,探究高茶氨酸茶树新品系‘福黄1号’的黄化变异和高茶氨酸形成机理。【方法】以茶树‘福安大白茶’及其黄化突变种质‘福黄1号’为试验材料,利用超微电镜、广泛靶向代谢组学、靶向代谢组学及转录组学联合分析,确定茶树黄化变异相关的色素、代谢物及转录组数据。【结果】超微结构显示,‘福黄1号’的叶绿体类囊体呈现丝状,基粒片层排列散乱不规则,片层间疏松,存在许多异常的囊泡。色素含量测定表明,叶绿素a和叶绿素b含量显著下降,叶绿素a/b比率下降,相关基因SGR表达显著下调,黄化叶片中光捕获叶绿素a/b蛋白（LHC）表达显著下调。类胡萝卜素总含量虽然差异不大,但各组分含量显著变化,玉米黄质为唯一显著增加的组分,其调控基因VDE表达显著上调,其余组分含量均下降。与‘福安大白茶’相比,‘福黄1号’中共鉴定到680个差异表达基因（DEGs）和57个显著变化的代谢物（SCMs）。KEGG富集分析表明,SCMs和DEGs显著富集到氨基酸生物合成、谷胱甘肽代谢以及TCA循环等途径。此外,与碳和氮代谢相关的通路也被激活。通过靶向测定,共鉴定到19种游离氨基酸,新品系‘福黄1号’游离氨基酸含量显著高于‘福安大白茶’,达到97.13 mg∙g^-1,其中茶氨酸为66.90 mg∙g^-1,占氨基酸含量的68.89%,而精氨酸含量达到8.46 mg∙g^-1,是‘福安大白茶’的56.4倍。调控氨基酸合成的GOGAT和GLU的表达量上调1.17倍和3.17倍。【结论】‘福黄1号’的芽叶色泽主要受叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮等色素代谢的影响,SGR和4种LHCs的共同作用也可能影响叶绿体的生物合成来调节叶片色泽。‘福黄1号’茶氨酸含量显著高于‘福安大白茶’的原因主要是泛素化相关的蛋白质水解酶表达上调蛋白降解能力加强,叶绿素和其他含氮分子生物合成的减少,以及黄化叶中碳骨架的缺乏,氨基和氮资源被更有效地储存,使得与氨基酸合成相关的氮代谢激活,茶氨酸合成前体物质之一的谷氨酸积累,这可能促使茶氨酸成为黄化叶中显著积累的含氮化合物。     

‘红地球’葡萄花芽分化过程中的转录组分析

【目的】 葡萄是我国重要的果树树种,花芽分化直接影响葡萄的质量和数量。对‘红地球’葡萄花芽分化过程中的花芽进行比较分析,探索‘红地球’葡萄花芽分化机制,挖掘关键基因,为了解‘红地球’葡萄花芽分化提供理论基础。【方法】 对‘红地球’葡萄花芽分化过程中4个发育阶段：S1（未分化期）、S2（花原始体发育期）、S3（花序主轴发育期）和S4（花序二级轴发育期）的芽进行形态学观察和植物激素测定,并进行转录组测序分析及验证。【结果】 ‘红地球’葡萄花芽分化过程中共发现13 729个差异基因,其中S1-S2、S2-S3、S3-S4和S1-S4分别有4 158、2 050、3 425和7 652个差异基因。在S1-S4差异基因的富集调控网络中发现差异基因在激素介导的信号通路、脱落酸代谢过程、对酸性化学物质的反应和植物细胞壁组织或生物发生等通路富集。在激素介导的信号通路中发现大量与生长素、赤霉素和脱落酸等相关基因,测定表明,生长素在S2时期含量最高,而在S3和S4时期含量最低;赤霉素含量在花芽分化过程中不断降低,在S4时期为S1时期的80%;脱落酸含量在S1和S4时期较高,而在S2时期最低。此外,S1-S4差异基因来自转录因子家族（MYB、ERF、bHLH和MADS-box等）,表明这些转录因子家族基因参与了‘红地球’葡萄花芽分化。对差异表达的13个MADS-box家族基因进一步分析表明,MADS8、AGL65、AGL15、AGL12和MADS2在花芽分化进程中表达上调,而AGL30、LeMADS、FBP24、AGL14和MADS3表达下调。对这些MADS-box基因进行qRT-PCR验证,基因表达趋势与转录组数据一致且相关系数较高,表明数据分析结果可靠。【结论】 ‘红地球’葡萄花芽分化是一个复杂的生物过程,其中,植物激素介导的信号通路以及MADS-box家族基因在花芽分化中发挥重要作用。研究结果提供了一个关于转录因子、基因和激素的信息,有助于揭开这一复杂的发育过程,并为‘红地球’葡萄花芽分化综合模型的建立提供理论基础。     

低温对甘薯淀粉理化特性及代谢关键基因表达量的影响

【目的】淀粉是甘薯块根的主要组成成分,淀粉理化特性直接决定着甘薯的主要用途;同时,甘薯是较为典型的喜温作物,对储藏温度较为敏感。因此,研究低温对淀粉理化特性的影响,为甘薯安全储藏提供参考。【方法】本研究以‘烟薯25’和‘商薯19’为试验材料,设置适温（13℃,CK）和低温（4℃）储藏14 d,分析甘薯块根淀粉粒径大小与分布、热焓特性、糊化特性、吸湿性及膨胀力等特征指标的差异。【结果】不同甘薯品种的直链/支链淀粉含量存在显著差异,‘商薯19’的直链淀粉含量（31.47%）显著高于‘烟薯25’（25.86%）,支链淀粉则完全相反;‘烟薯25’和‘商薯19’的平均粒径、体积和表面积均分别分布于≤2.50 μm、2.50—5.00 μm和5.00—25.00 μm三个区间,低温胁迫使二者的淀粉颗粒平均粒径降低,体积和表面积减小,吸湿性和膨胀力降低;‘烟薯25’和‘商薯19’薯块淀粉在糊化过程中的起始温度（T₀）、峰值温度（Tp）和热晗值（△H）与CK相比均显著下降,其中,‘烟薯25’的△H变化幅度高于‘商薯19’,表明低温对‘烟薯25’淀粉热特性的影响程度高于‘商薯19’;低温储藏条件下,‘烟薯25’和‘商薯19’的最高黏度（PKV）、崩解值（BDV）和回复值（CSV）均显著下降,糊化温度（PT）受低温的影响不显著,但品种间差异显著;低温下,基因IbAGPa（ADP-葡萄糖焦磷酸化酶）、IbAGPb、IbSBEI（淀粉分支酶）和IbSBEII的表达量均显著下降,而Ibα-amylase（淀粉水解酶）和Ibβ-amylase则显著上升。【结论】温度是影响甘薯淀粉理化品质的重要因素,甘薯块根淀粉理化特性变化与甘薯储藏温度密切相关。     

甜瓜幼果果皮颜色基因GR的精细定位

【目的】 探究甜瓜幼果果皮颜色性状的遗传规律,精细定位目标性状基因GR,加深对甜瓜发育过程中果皮颜色转变的认知,为开展甜瓜果皮颜色的分子设计育种奠定基础。【方法】 以幼果深绿皮的薄皮甜瓜纯系‘MR-1’和幼果浅绿皮的厚皮甜瓜纯系‘LGR’为亲本,构建F₁正反交群体;以及利用F₁与浅绿皮亲本‘LGR’杂交构建BC₁F₁回交群体,对甜瓜幼果果皮颜色基因GR（Green Rind）进行遗传分析。选取BC₁F₁群体中深绿皮和浅绿皮单株各20株,混池其DNA进行BSA-seq以获取GR初定位区间。基于‘MR-1’和‘LGR’两亲本的重测序数据,开发初定位区段内特异性较好的分子标记,鉴定筛选扩大群体（BC₁F₁和F₂）中的重组交换单株,验证和缩小定位区间,实现GR精细定位。将两亲本定位区段内注释基因的编码区进行测序以确定候选基因和关键变异位点。通过调查BC₁F₁回交群体中幼果果皮颜色和成熟果果皮颜色,利用相关性分析探究果皮颜色转变在甜瓜发育过程中的内在联系。【结果】 通过分析F₁群体果皮颜色发现所有F₁单株幼果都表现为深绿皮。另外,BC₁F₁群体单株幼果果皮颜色会发生分离,其中深绿皮单株数﹕浅绿皮单株数约等于1﹕1,以及F₂群体中深绿皮植株与浅绿皮植株的分离比为3﹕1。这些分离比都符合孟德尔遗传定律,表明幼果果皮颜色是受单个核基因GR控制的质量性状,并且深绿对浅绿为显性。通过BSA-seq分析将基因初步定位于4号染色体长臂,物理距离为1.8 Mb的范围内。利用开发的分子标记在扩大的定位群体中共筛选到24个重组交换单株。经过后代基因型和表型验证,最终将GR精细定位在标记4-102和4-81之间约17.7 kb的范围内,区段内共包含4个注释基因。经测序分析发现一个编码GLKs类转录因子CmAPRR2的基因MELO3C003375在亲本‘MR-1’和‘LGR’中存在多处变异,其中有3处发生了同义突变,1处错义突变和1处无义突变。无义突变出现在MELO3C003375的编码区第856位碱基处（由G变成T）,导致亲本‘LGR’中蛋白翻译提前终止,其Myb-DNA结合结构域大部分缺失,推测基因MELO3C003375（CmAPRR2）即为影响甜瓜幼果果皮颜色的基因,而第856位的单碱基替换造成的无义突变即为关键变异位点。此外,BC₁F₁回交群体单株的表型调查结果显示幼果与成熟果的果皮颜色之间存在显著相关性。【结论】 甜瓜幼果果皮颜色（深绿/浅绿）性状为质量性状,受单个核基因GR控制。通过遗传定位手段推断MELO3C003375（CmAPRR2）为最有可能影响甜瓜幼果果皮颜色的候选基因。     

不同苹果砧木对持续低磷的响应及适应性评价

【目的】研究7种苹果砧木幼苗对低磷胁迫的响应特征,评价不同砧木的低磷适应性,为耐低磷苹果砧木的选用及磷高效利用生理机制的研究提供理论依据。【方法】以生产中常用的5种苹果矮化砧木（‘T337’‘Nic29’‘Pajam2’‘B9’‘71-3-150’）、半矮化砧木‘青砧2号’（Qingzhen 2）和乔化砧‘山定子’（Malus baccata (L.) Borkh.）为材料,通过盆栽沙培试验的方法,研究各砧木在正常供磷和低磷条件下树体生长、光合作用、叶片形态及根系构型、生物量积累、磷吸收利用及转运分配的差异。【结果】低磷条件下,‘T337’‘Nic29’‘Pajam2’和‘山定子’的地上部生长和植株生物量积累显著下降,‘山定子’和‘青砧2号’的平均叶面积显著降低,其中‘山定子’的叶片SPAD值与正常供磷相比下降了9.47%。与对照相比,低磷条件下‘B9’的平均叶面积、叶片长度和叶片宽度均显著升高,‘71-3-150’和‘青砧2号’的叶片SPAD值显著提高,‘B9’‘71-3-150’‘Nic29’和‘青砧2号’的F₀显著升高,F_v/F_m显著降低,‘71-3-150’下降最明显。‘T337’‘Nic29’‘山定子’和‘青砧2号’在低磷条件下根系生长均受到明显抑制,根系总表面积、总根长显著降低,其中‘T337’降幅最大;‘B9’和‘71-3-150’的根系总表面积和根总体积均显著增加,植株根冠比显著提高,其中‘71-3-150’根冠比增幅最大,是对照的1.54倍。低磷条件下,‘71-3-150’‘Nic29’‘Pajam2’‘山定子’和‘青砧2号’的磷利用效率和磷转运系数降低,‘71-3-150’‘Nic29’‘Pajam2’和‘山定子’的地上部磷累积量减少,而根系磷含量和累积量高于对照,‘71-3-150’的根系磷累积量增幅最大。采用最大方差法正交旋转得出与耐低磷性最相关的13个主成分因子,利用隶属函数对13个主成分因子进行综合评价,结合聚类分析可以将7种苹果砧木分为4种耐性类型：第Ⅰ类为耐性强的砧木（‘B9’和‘71-3-150’）,第Ⅱ类为耐性较强的砧木（‘T337’和‘青砧2号’）,第Ⅲ类为耐性较弱的砧木（‘Nic29’和‘Pajam2’）,第Ⅳ类为耐性最弱的砧木（‘山定子’）。【结论】低磷条件下,苹果砧木通过减少叶片光合作用的物质消耗,增加植株根系磷累积量,促进根系发育,提高植株根冠比,以适应低磷环境;不同砧木的适应能力存在显著差异。     

树上干杏开花坐果期内源激素变化规律

【目的】测定树上干杏开花坐果期3种内源激素含量的动态变化,研究内源激素对树上干杏开花、落花及坐果的调控机制,为树上干杏内源激素在花期调控,提高杏坐果提供理论基础。【方法】以10年生树上干杏植株为材料,分别于花期、坐果期,采集花芽、花朵或幼果,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定其内源激素赤霉素(GA₃)、油菜素内酯(BR)和脱落酸(ABA)的含量。【结果】内源激素GA₃含量194.12 ~511.17 pg/mL范围内,对花芽的发育起促进作用,幼果的发育需要较高水平的GA₃;内源激素BR(125.8~153.65 ng/L)对花芽发育以及成花具有促进作用,坐果期初期较高含量的BR可能利于幼果的发育;低含量(72.71 ~105.12 μg/L)的ABA可能利于花芽萌动,激素间相关性分析显示ABA与BR含量、ABA与GA₃含量、BR与GA₃含量极显著相关。【结论】花芽膨大期初期GA₃含量最低,盛花期末期达到峰值,之后呈下降趋势;内源激素BR含量在露萼期和盛花期出现峰值,从盛花末期开始下降;花芽膨大期ABA含量处于低水平状态,之后总体为上升趋势,盛花末期ABA含量达到峰值后下降。高含量的ABA可能会促进杏花开放衰老,低水平的ABA可能利于幼果生长发育。     

SO2引起巨峰葡萄采后落粒的共表达网络和转录调控分析

【目的】 二氧化硫（SO₂）处理可有效防治葡萄灰霉病和采后腐烂,但会导致浆果脱落,研究SO₂引起葡萄浆果脱落的分子机制,明确关键基因和转录调控机制。【方法】 使用SO₂处理‘巨峰’葡萄,分别在2、4和6 d进行采样并统计对照组（CK）和SO₂处理组的葡萄浆果脱落率。通过高通量测序技术对CK对照组和SO₂处理组‘巨峰’葡萄采后2、4和6 d的样品测序,以葡萄基因组作为参考基因组进行序列比对,利用TPM算法计算基因表达量,使用基因集富集分析（GSEA）、基因共表达网络（GCN）以及转录调控网络预测方法对转录组数据进行系统的分析,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其表达量进行验证。【结果】 SO₂处理能够显著诱导葡萄浆果脱落,2 d时,SO₂处理的葡萄浆果脱落率为9.88%,4 d时达到19.24%,且均显著高于对照组,6 d时脱落率达到38.25%,而对照组脱落率仅11.85%。通过GSEA分析,发现在CK组富集的GO生物过程主要与氧化应激反应、细胞壁代谢以及苯丙氨酸代谢通路相关,其中4 d时CK组富集到植物细胞壁组织、果胶代谢、细胞壁修饰、聚半乳糖醛酸等通路。在SO₂组富集的GO生物过程主要与能量代谢通路相关,其中2 d时在SO₂组富集到光合作用、四吡咯代谢、前体代谢物和能量的产生、葡萄糖代谢等通路。CK组富集的KEGG代谢通路主要有戊糖和葡萄糖醛酸的相互转换、半乳糖代谢、植物激素信号转导、柠檬酸循环（TCA循环）等,SO₂组有光合作用、柠檬酸循环（TCA循环）、糖酵解等。GCN将GSEA分析中的领头基因分为12个水平,水平4—9均富集到了能量代谢、糖代谢相关通路,其中水平4富集到激素反应、氧化应激反应。对GCN关键水平中的基因启动子序列进行转录调控预测分析,结果显示95个转录因子（TFs）与269个靶基因存在987对调控关系。WRKY14、WOX8、KUA1在SO₂处理下持续下调,MYB60、MYB73、ANL2、ERF2、DOF3.6、GATA25、WRKY57、KAN2、ATHB6在SO₂处理后持续上调。此外,MYB15、WRKY11、WRKY33、WRKY40、WRK75先上调后下调。ERF2、MYB60和WRKY40的转录调控网络发现调控的靶基因涉及细胞壁代谢、糖代谢等相关途径。qRT-PCR结果显示PME36和ERF2上调表达趋势相似,GAUT7、MYB60、UGE3上调表达趋势相似,此外,WRKY40在SO₂处理的2和4 d被诱导上调,PPME1、COMT1表达持续下调,SO₂处理4 d时LAC15被显著诱导上调。【结论】 SO₂诱导营养物质代谢、能量代谢、细胞壁代谢途径相关基因的表达,该过程受到多种转录因子调控,最终导致葡萄浆果脱落。     

优质高产常规籼型糯稻‘珍珠糯’产量性状分析

为了进一步挖掘优质高产籼糯品种‘珍珠糯’的高产潜力,提高种植效益,利用近年来信阳市农业科学院水稻品比试验结果数据,对‘珍珠糯’的全生育期(x₁)、株高(x₂)、有效穗(x₃)、穗长(x₄)、穗粒数(x₅)、结实率(x₆)、千粒重(x₇)和产量(y)进行相关、通径和回归分析。结果表明,‘珍珠糯’各农艺性状变异系数表现为穗粒数>有效穗>穗长>结实率>产量>千粒重>株高>全生育期,变化范围5.27%~19.74%;相关、通径和回归分析发现,有效穗、穗粒数和结实率对产量的作用最大,其与产量的相关系数、偏相关系数和直接通径系数达到极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)水平,综合决定效应穗粒数>结实率>有效穗;用逐步回归筛选出有效穗、穗粒数和结实率3个对‘珍珠糯’产量有显著效应的自变量建立了最优回归方程y=1729.381+8.859x₃+7.743x₅+37.755x₆。综上,有效穗、穗粒数和结实率是影响‘珍珠糯’产量的主要性状,在推广应用以及高产创建时要注意在一定有效穗的基础上,采取措施提高穗粒数和结实率。     

陆地棉半矮秆突变体sd株高对外源激素的敏感性

【目的】研究外源激素对棉花矮化突变体株高的影响,确定其对激素的敏感性,为利用其分析棉花株高遗传基础与激素调控关系提供依据。【方法】以棉花品种新陆早17号(CK)及其矮化突变体sd为材料,采用GA₃、IAA和BR激素分别处理后,研究不同激素和不同浓度处理对棉花株高的影响。【结果】突变体sd的株高约为新陆早17号的四分之三,突变体sd是一份典型的陆地棉半矮秆突变体。不同浓度GA₃处理后,新陆早17号的株高变化量高于突变体,50 mg/L的GA₃处理能使突变体sd的株高恢复到新陆早17号的株高水平,激素影响棉花株高的主次顺序为GA₃＞BR＞IAA,株高与GA₃具有显著的正相关性。【结论】突变体sd是一份典型的陆地棉半矮秆突变体,突变体sd的株高对GA₃敏感。     

梅花不同花色品种及开花阶段类黄酮代谢物测定与分析

【目的】花色是梅花（Prunus mume）极其重要的观赏性状，类黄酮是梅花花瓣中的主要色素，但目前关于梅花类黄酮化合物的组成及其与花色关系的研究较少。研究梅花类黄酮化合物可为梅花花色形成机理以及梅花类黄酮资源开发提供参考。【方法】本研究选取4个代表花色的梅花品种盛花期及两个品种花色变化关键时期花瓣作为试验材料，首先采用RHSCC比色卡比色法和色差仪测定不同品种各时期花瓣的花色表型，用高效液相色谱质谱联用技术（high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS）对各品种不同开花时期的类黄酮组成进行定性、定量研究，进一步通过Duncan检验和正交偏最小二乘判别分析不同花色品种间差异代谢物以及开花过程中与花色变化相关的类黄酮代谢物。【结果】在梅花花瓣中共鉴定出25种黄酮类化合物。其中，红色‘白须朱砂’和紫红色‘虎丘晚粉’的主要成分为花青素类化合物，‘白须朱砂’和‘虎丘晚粉’间矢车菊素及其衍生物含量存在差异。从大蕾期到盛花期，‘白须朱砂’红色逐渐变浅，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药花素-3-O-葡萄糖苷的含量也逐...     

GA3介导miR171s及其靶基因VvSCLs调控葡萄种子发育的作用分析

【目的】鉴定vvi-miR171s成员及其靶基因,明确vvi-miR171s成员及其靶基因在葡萄种子发育中的重要作用及其响应赤霉素（Gibberellin,GA）调控种子发育的表达模式。【方法】以‘魏可’葡萄（‘Wink’）果实为试材,利用miR-RACE技术鉴定vvi-miR171a/b/e/f/g/h的成熟体序列;通过PsRNATarget软件预测vvi-miR171s的靶基因,利用生物信息学软件对其进行染色体定位、系统进化树、基因结构、保守结构域及motif分析;通过启动子作用元件分析预测vvi-miR171s及其靶基因的潜在功能;采用RLM-RACE和PPM-RACE验证vvi-miR171s对靶基因的裂解作用;利用qRT-PCR鉴定其应答外源GA₃在葡萄种子区中的表达模式。【结果】从‘魏可’葡萄果实中鉴定并克隆了6条葡萄vvi-miR171s成熟体序列,并用RLM-RACE和PPM-RACE鉴定到3条靶基因VvSCL6/15/22。靶基因的生物信息学分析显示,VvSCL6/22与苹果、桃子和樱桃同源基因遗传距离较近,而VvSCL15则与拟南芥、苹果、桃子和樱桃中的同源基因遗传距离相同,且VvSCLs的基因结构也与进化树中亲缘关系较近的基因相似;SCLs蛋白均具有GRAS结构域,鉴定到5个与GRAS结构域对应的保守motif,且它们含有的motif元件类型及排列顺序均相似,表明SCL家族结构较为保守。vvi-miR171s及靶基因的启动子均具有大量的GA、水杨酸（Salicylic acid,SA）和种子发育相关作用元件,表明它们可能参与响应GA、SA和种子发育过程;qRT-PCR表达分析显示,GA₃强烈抑制了种子区vvi-miR171a的表达,但同时显著上调种子区的VvSCL15和VvSCL22表达;vvi-miR171a和VvSCL15在对照组和GA₃处理后的种子/种子区均呈强烈的负相关,表明GA₃可能在葡萄种子/种子区显著增强vvi-miR171a对VvSCL15的负调控作用,从而介导葡萄种子发育。【结论】在‘魏可’葡萄中鉴定到vvi-miR171a/b/e/f/g/h 6个成员;均可裂解VvSCl6/15/22 3个靶基因;vvi-miR171a-VvSCL15可能作为主要的调控途径响应赤霉素并参与调控葡萄种子发育。     

‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因DkGAI2的克隆与功能分析

【目的】 对DkGAI2的亚细胞定位及表达特性进行分析,并将DkGAI2转化烟草,分析转基因烟草的生理和形态指标,为GAI的深入研究提供理论基础。【方法】 以‘南通小方柿’高通量转录组测序结果中标注的GAI2为原始序列（未发表）,利用RT-PCR,3′ RACE和5′ RACE技术从‘南通小方柿’中克隆得到DkGAI2的序列全长。利用生物信息学分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析DkGAI2在‘大方柿’及‘南通小方柿’5个不同物候期的表达特性以及DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中的表达特性,构建瞬时表达载体pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2,并瞬时侵染烟草分析DkGAI2的亚细胞定位,通过构建DkGAI2植物双元表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,经过GUS染色、RT-PCR对转基因烟草株系进行鉴定;并将野生型和转基因烟草移栽,于第一朵花开放时测定转基因植株的株高、节间长度、叶片长宽比以及GA₁和GA₄含量。【结果】 从‘南通小方柿’中克隆得到了1 827 bp的DkGAI2,DkGAI2核苷酸序列与猕猴桃（KF588651.1）、光皮烨（MF149049.1）、砂梨（KX078214.1）、苹果（FJ535245.1）、葡萄（MG738718.1）的相似度达72%-80%,DkGAI2具有DELLA蛋白家族特有的DELLA结构域,属于DELLA蛋白基因家族。DkGAI2编码608个氨基酸,相对分子质量为66.5 kD,理论等电点为5.54,不稳定系数为50.41,无明显疏水区,无跨膜区,无信号肽。序列系统进化分析结果显示,DkGAI2与葡萄亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量都高于‘大方柿’;DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中表现出组织表达特异性,其中,在老叶中表达量最高,其次为茎尖和幼叶,而在幼果中几乎不表达。pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2融合蛋白的绿色荧光信号位于细胞核中,表明DkGAI2编码蛋白位于细胞核。经过GUS染色和RT-PCR检测,共获得5个转DkGAI2烟草株系,转基因烟草叶片GA₁含量增加,GA₄含量降低,GA₁和GA₄总含量降低,且转基因烟草植株出现植株矮化、节间缩短、叶片长宽比降低及花期延迟的表型。【结论】 DkGAI2具有组织表达特异性,定位于细胞核,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量均高于‘大方柿’。推测DkGAI2可能通过降低GA₄的含量进而引起植株矮化。     

NaCl处理对酸枣幼苗内源激素含量的影响

【目的】研究不同浓度NaCl处理对酸枣幼苗叶和根系内源激素含量的影响。【方法】利用高效液相色谱法,测定不同NaCl浓度处理及不同时间下,酸枣幼苗叶、根中脱落酸、生长素、赤霉素、玉米素4种内源激素的含量。【结果】与0 mmol/L NaCl处理相比,处理时间相同时,酸枣幼苗叶和根在50、100、150、200 mmol/L NaCl处理下ABA含量显著增加,IAA、ZT、GA₃的含量、IAA/ABA、GA₃/ABA的比值整体显著下降。与处理0 h相比,不同浓度NaCl处理下,随着处理时间的延长,酸枣叶,根的ABA含量显著升高,IAA/ABA、GA₃/ABA的比值均显著降低;100 mmol/L NaCl处理下,酸枣叶和根的GA₃、IAA、ZT含量显著下降。【结论】NaCl处理下,处理时间相同时,酸枣幼苗通过增加叶和根ABA含量,降低叶和根IAA、ZT、GA₃含量、IAA/ABA和GA₃/ABA的比值适应盐胁迫。     

芒果MiZAT10A和MiZAT10B功能分析

【目的】锌指蛋白（zinc finger protein,ZFP）在植物非生物胁迫应答中起重要的作用,研究两个锌指蛋白基因MiZAT10A和MiZAT10B转入拟南芥对盐、干旱、重金属以及外源激素等非生物胁迫的应答,为抗逆育种提供理论依据。【方法】利用在线软件PLACE和MEME分别对芒果MiZAT10A和MiZAT10B进行启动子顺式作用元件以及motif预测和分析,并利用TBtools软件和‘四季蜜芒’基因注释文件（GFF文件,未公开）绘制染色体定位图;通过实时荧光定量分析MiZAT10A和MiZAT10B的组织表达模式;构建芒果MiZAT10A和MiZAT10B超量表达载体,采用农杆菌花序浸染法转化模式植物拟南芥,观察并记录转基因拟南芥开花表型以及在盐、干旱、重金属以及外源激素脱落酸和赤霉素处理下的根生长情况。【结果】启动子顺式元件分析显示,两个基因的启动子区域都有许多光响应元件、激素响应元件和非生物胁迫响应元件。表达模式分析显示,MiZAT10A与MiZAT10B在芽和花中表达水平最高。MiZAT10A和MiZAT10B分别获得了9株和14株转基因拟南芥,开花表型分析显示,Mi...     

不同生长状况下新疆野苹果内源激素含量的变化

【目的】分析不同生长状况下新疆野苹果野果林在生长发育过程中内源激素的变化规律,为新疆野苹果保护研究提供科学依据。【方法】分别于不同发育周期、不同年限、不同生长状况的新疆野苹果叶片与果实鲜样,采用高效液相法测定IAA、GA₃、ABA、ZR、JA这5种激素的含量。【结果】从6~9月,正常的新疆野苹果叶片ZR、GA₃含量下降,JA、IAA、ABA含量上升;退化的新疆野苹果叶片ZR、JA、GA₃、IAA、ABA含量上升;退化和正常的果实ZR、JA、GA₃、IAA变化趋势相同,均呈下降的趋势。2018年相比于2017年,正常的新疆野苹果叶片ZR、JA、ABA含量上升,GA₃、IAA 含量下降;退化的新疆野苹果叶片ZR、ABA含量上升,GA₃、IAA 含量下降;正常和退化的果实内源激素含量变化趋势相同,均是JA 含量上升,ZR、GA₃、IAA、ABA 含量下降。在5种不同存活率的新疆野苹果中,得出100%存活率新疆野苹果林叶片的IAA、ZR、GA₃含量最高,20%存活率新疆野苹果林叶片的JA含量最高,10%存活率新疆野苹果林叶片的ABA含量最高,得出存活率越高,促进生长的激素含量也会越高。【结论】2种不同生长状况下,新疆野苹果5种内源激素含量在不同月份和不同年份表现出不同趋势。     

紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶（squalene epoxidases,SQE）是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶（MsSQE1）基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA₃条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA₃的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高; GA₃（50 μmol·L ^-1）和 ABA（100 μmol·L ^-1）处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。     

vvi-miR172s及其靶基因响应赤霉素调控葡萄果实发育的作用分析

【目的】miR172是植物生长发育的重要调节因子,阐释vvi-miR172s及其靶基因应答赤霉素在葡萄果实不同组织发育过程中的作用,从miRNA角度认识GA调控葡萄果实发育的作用机制。【方法】以‘白罗莎里奥’葡萄为材料,以miR-RACE和PCR技术克隆vvi-miR172a/b/c/d的成熟体和前体序列,由psRNA Target软件预测vvi-miR172s的靶基因;利用RLM-RACE技术验证vvi-miR172s剪切靶基因的裂解作用及其作用位点;采用生物信息学软件对靶基因、靶蛋白进行系统进化、序列结构分析及亚细胞定位预测;通过在线软件PLANTCARE进行启动子作用元件分析;通过qRT-PCR和芯片数据分析vvi-miR172s和靶基因在不同器官、不同发育阶段的基因表达图谱,以及应答GA₃在果实不同组织中的时空表达模式。【结果】克隆鉴定了vvi-miR172a/b/c/d的成熟体和前体序列,预测到VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2和VvRAP2-3四个靶基因,验证到裂解产物及其裂解位点,证明它们为vvi-miR172s的真实靶基因。序列结构分析显示,VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2、VvRAP2-3均含有10个外显子和9个内含子,其motif元件的种类和数量相似,均含有两个排列顺序相近的AP2蛋白结构域,表明其结构和功能具有一定的保守性;且VvAP2、VvRAP2-1和VvRAP2-2与杨树的亲缘关系较近,VvRAP2-3与大豆具有较高的同源性;靶基因蛋白二级结构均为α-螺旋,可进一步折叠为稳定的三级结构;4个靶蛋白亚细胞定位主要位于细胞核内。启动子作用元件分析发现vvi-miR172c和VvRAP2-1中含有赤霉素响应元件,表明它们可能响应赤霉素调控葡萄生长发育;芯片数据分析显示vvi-miR172c和靶基因的表达模式具有组织或器官特异性,且它们之间呈现一定的负相关,表明它们之间存在负调控作用;RT-qPCR结果显示,随着葡萄果实的发育,果皮中vvi-miR172a/b/d呈下降的表达趋势,而靶基因VvRAP2-1的表达模式相反,表明vvi-miR172a/b/d对VvRAP2-1负调控;果肉中vvi-miR172d的表达水平降低,而靶基因VvAP2的表达水平增加,表明vvi-miR172d与VvAP2呈负相关性。另外,GA₃处理改变了vvi-miR172s的靶模式,增强了果肉和果皮组织中vvi-miR172d与VvRAP2-1的负相关性,同时诱导了vvi-miR172c对VvAP2/VvRAP2-2/VvVvRAP2-3的负调控作用。【结论】VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2、VvRAP2-3均为葡萄miR172a/b/c/d的真实靶基因,vvi-miR172家族可能通过vvi-miR172a/b/d和vvi-miR172d分别介导靶基因VvRAP2-1和VvAP2调控果皮和果肉组织的发育过程,而vvi-miR172c和vvi-miR172d及其靶基因可能是GA调控葡萄果皮与果肉组织发育的主要作用因子。