植物谷胱甘肽应答非生物胁迫的分子机制

谷胱甘肽(GSH)是一种普遍存在于植物中的抗氧化剂,在维持组织抗氧化防御和调节氧化还原敏感信号转导中起着关键作用。深入研究GSH在非生物胁迫中的作用,对从分子水平揭示植物GSH积累的调控机制具有重要意义。本研究从植物GSH代谢途径及其相关酶、GSH在植物应激反应中的调节、GSH参与植物激素代谢等方面进行综述,并对谷胱甘肽在植物生长发育、与其它信号通路间交互作用的研究前景进行展望,以期为植物谷胱甘肽代谢以及其在非生物胁迫方面的研究提供一定的理论参考。     

vvi-miR160s介导VvARF18应答赤霉素调控葡萄种子的发育

【目的】研究vvi-miR160家族（vvi-miR160s）及其靶基因在‘魏可’葡萄种子发育过程中的作用,探究其应答赤霉素（GA）调控葡萄果实无核的潜在机理。【方法】采用miR-RACE、生物信息学分析、RT-qPCR、RLM-RACE等方法,鉴定vvi-miR160家族成员及其靶基因,分析vvi-miR160s及其靶基因应答GA的时空表达模式及其潜在功能。【结果】花前GA处理强烈抑制‘魏可’葡萄胚珠及种子发育,高效诱导其无核,且无核率达99.8%。克隆鉴定了VvMIR160s前体基因序列（501 bp）及成熟体序列,且它们在不同物种间具有较高的保守性;基于vvi-miR160s序列,预测到靶基因VvARF18,利用RLM-RACE技术检测到vvi-miR160s对VvARF18的裂解位点在第10和第11位之间,裂解频度9/17,证明VvARF18是vvi-miR160s的真实靶基因。该靶基因编码683个氨基酸,在398—411位存在核定位信号,且该蛋白亚细胞定位于细胞核上。VvARF18与其他物种间序列的同源保守性较高,基因结构相似,其中VvARF18蛋白与茶、烟草、梅花等物种亲缘关系较近。VvARF18启动子中包含4种作用元件,且含有较多激素相关元件。RT-qPCR结果显示,随着葡萄果实的发育,vvi-miR160c/d/e呈现‘V’形表达趋势,在硬核种子发育期表达较低,而VvARF18表现出与前者相反的表达趋势,在硬核种子发育期呈现高表达,表明vvi-miR160c/d/e对VvARF18负调控,但vvi-miR160a/b与VvARF18表达水平却不存在明显负相关。GA处理极显著地上调了vvi-miR160a/b在葡萄硬核种子发育期的表达,同时也显著抑制了VvARF18在同时期的表达,且它们的表达水平呈负相关,表明GA处理促进了vvi-miR160a/b对VvARF18的负调控作用;相反,GA减弱了vvi-miR160c/d/e对VvARF18的负调控作用。【结论】在vvi-miR160家族中,vvi-miR160c/d/e可能介导VvARF18在葡萄种子发育的特定阶段调控种子的发育形成,而vvi-miR160a/b可能主要介导VvARF18参与调控GA诱导葡萄种子败育的过程。     

GA3介导miR171s及其靶基因VvSCLs调控葡萄种子发育的作用分析

【目的】鉴定vvi-miR171s成员及其靶基因,明确vvi-miR171s成员及其靶基因在葡萄种子发育中的重要作用及其响应赤霉素（Gibberellin,GA）调控种子发育的表达模式。【方法】以‘魏可’葡萄（‘Wink’）果实为试材,利用miR-RACE技术鉴定vvi-miR171a/b/e/f/g/h的成熟体序列;通过PsRNATarget软件预测vvi-miR171s的靶基因,利用生物信息学软件对其进行染色体定位、系统进化树、基因结构、保守结构域及motif分析;通过启动子作用元件分析预测vvi-miR171s及其靶基因的潜在功能;采用RLM-RACE和PPM-RACE验证vvi-miR171s对靶基因的裂解作用;利用qRT-PCR鉴定其应答外源GA₃在葡萄种子区中的表达模式。【结果】从‘魏可’葡萄果实中鉴定并克隆了6条葡萄vvi-miR171s成熟体序列,并用RLM-RACE和PPM-RACE鉴定到3条靶基因VvSCL6/15/22。靶基因的生物信息学分析显示,VvSCL6/22与苹果、桃子和樱桃同源基因遗传距离较近,而VvSCL15则与拟南芥、苹果、桃子和樱桃中的同源基因遗传距离相同,且VvSCLs的基因结构也与进化树中亲缘关系较近的基因相似;SCLs蛋白均具有GRAS结构域,鉴定到5个与GRAS结构域对应的保守motif,且它们含有的motif元件类型及排列顺序均相似,表明SCL家族结构较为保守。vvi-miR171s及靶基因的启动子均具有大量的GA、水杨酸（Salicylic acid,SA）和种子发育相关作用元件,表明它们可能参与响应GA、SA和种子发育过程;qRT-PCR表达分析显示,GA₃强烈抑制了种子区vvi-miR171a的表达,但同时显著上调种子区的VvSCL15和VvSCL22表达;vvi-miR171a和VvSCL15在对照组和GA₃处理后的种子/种子区均呈强烈的负相关,表明GA₃可能在葡萄种子/种子区显著增强vvi-miR171a对VvSCL15的负调控作用,从而介导葡萄种子发育。【结论】在‘魏可’葡萄中鉴定到vvi-miR171a/b/e/f/g/h 6个成员;均可裂解VvSCl6/15/22 3个靶基因;vvi-miR171a-VvSCL15可能作为主要的调控途径响应赤霉素并参与调控葡萄种子发育。     

巨峰葡萄Rs基因的克隆鉴定、序列分析与时空表达特征研究

探究白藜芦醇合酶(Resveratrol synthase,Rs)在巨峰葡萄果实发育中的潜在作用。对其序列进行结构及功能分析,并鉴定其在果实不同发育时期的时空表达特异性。采用生物信息学分析及qRT-PCR的方法,对巨峰葡萄Rs基因序列进行分析,并对其结构和亚细胞定位进行预测,以及分析果实不同时期不同组织的表达情况。克隆得到的Rs基因cDNA全长1 539 bp,开放阅读框(ORF)为1 179 bp,编码392个氨基酸,预测蛋白分子质量42.88 ku,理论等电点(pI)为6.09,且该基因含有查耳酮和二苯乙烯合酶活性位点以及完整的芪合酶家族特征位点;蛋白互作预测发现,Rs和OMT2.1具有互作,后者可催化白藜芦醇生物合成紫檀芪;亚细胞预测结果表明,Rs基因主要在细胞质和叶绿体中表达;启动子分析发现,Rs基因表达可能受光照、MYB、真菌和激素的调控并存在一定的组织特异性。qRT-PCR表达分析显示,葡萄Rs基因在果皮和果肉中不同时期均有表达,但在花后25 d的青皮中表达量最高。结合Rs基因在白藜芦醇积累的作用,可以推测可能在果实发育前期的果皮中白藜芦醇有较高积累。巨峰葡萄Rs基因在进化过程中具有较高的保守性,其表达可能受环境、真菌和激素的调控且与OMT2.1具有互作效应。而且在不同的组织和时期存在一定的特异性。     

葡萄木质素相关基因PAL、4CL和CAD特征鉴定及其应答赤霉素在果实发育过程中的作用

[目的]本文旨在研究苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、4-香豆酸-辅酶连接酶基因(4CL)和肉桂醇脱氧酶基因(CAD)在葡萄(Vitis vinifera L.)‘白罗莎’核木质素合成过程中的作用,进而探究其在应答赤霉素(GA)调控果实发育尤其在种子发育过程中的潜在作用,分析其在诱导果实无核过程中的作用。[方法]采用生物信息学分析、基因芯片和RT-qPCR等方法,对葡萄VvPAL、Vv4CL和VvCAD基因定位、结构和启动子作用元件分析,对其编码蛋白相似性、结构域以及互作蛋白进行分析,并鉴定其应答GA在果实不同组织不同时期的表达模式。[结果]葡萄VvPAL、Vv4CL和VvCAD与其他物种同源分析比对发现,其内含子与外显子数量及其分布相似。基因启动子分析表明,3个基因均含有胚乳发育相关组织特异性元件,且Vv4CL基因含有GA响应元件。3个基因所编码蛋白进化保守性较强,与其他物种比对后发现它们含有相同的蛋白功能结构域并且作用元件相似。亚细胞定位预测显示其主要集中在细胞质和细胞膜中表达,其互作蛋白主要是肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、咖啡酸氧甲基转移酶(OMT)等木质素合成过程中的关键酶。葡萄芯片电子表达谱发现,VvPAL和Vv4CL基因在根、茎等木质化程度相对较高的组织中高表达,而VvCAD基因则只在种子中相对高表达。RT-qPCR结果显示,GA在种子某些特定时期极显著下调VvPAL、Vv4CL、VvCAD基因的表达。[结论]VvPAL、Vv4CL和VvCAD基因参与葡萄果实发育过程的调控,且GA可能通过下调这3个基因的表达从而抑制葡萄核发育。     

VvmiR396及其靶基因VvGRF1在葡萄种子发育过程中的表达分析

[目的]本文旨在鉴定葡萄miR396家族成员(VvmiR396)及其靶基因VvGRF1,探究VvmiR396-VvGRF1在种子败育/发育中的作用模式。[方法]通过miR-RACE、RLM-RACE、PPM-RACE、烟草共转化活体验证等方法鉴定VvmiR396及其靶基因，利用生物信息学分析其潜在功能与进化保守性，利用RT-qPCR方法检测VvmiR396在有核和无核品种中的时空表达差异及VvmiR396-VvGRF1相关性差异。[结果]与葡萄品种‘魏可’相比，‘京可晶’花后28 d时种子发育被严重抑制，出现败育且种子萎缩，而‘魏可’种子正常发育。对VvmiR396a、VvmiR396b、VvmiR396c、VvmiR396d的前体及其成熟体序列进行鉴定，其前体均可形成典型的茎环结构，成熟体序列均位于茎环的5′臂上。VvmiR396与烟草、番茄等物种的同源序列亲缘关系较近，而与小麦的亲缘关系较远。预测到VvmiR396的8条潜在靶基因，利用RLM-RACE、PPM-RACE技术体外鉴定到VvGRF1和VvGRF10是VvmiR396的真实靶基因，且VvmiR396对VvGRF1的裂解位...