梅PmmiR319a与靶基因PmTCP2的验证与表达分析

为验证PmmiR319a与PmTCP2基因的靶标关系,并研究PmmiR319a在梅花芽发育过程中的作用,本研究以梅品种‘大嵌蒂’为试验材料,克隆梅PmmiR319a前体序列及其靶基因PmTCP2,采用5'RACE技术对两者之间的靶标关系进行验证,并进一步分析在花芽发育过程中的表达模式。结果表明,梅PmmiR319a前体序列含有茎环结构,通过序列比对和系统发育分析发现,不同物种的miR319a前体序列的茎环发卡结构和成熟体区域表现出较高的保守性。梅PmTCP2基因全长1 500 bp,编码499个氨基酸。荧光定量PCR分析结果表明,PmmiR319a在梅花发育的前期表达量高,而PmTCP2在梅花发育的中期和后期表达量较高,PmmiR319a与预测靶基因PmTCP2的表达模式呈负相关,表明二者存在负调控的关系,与预测的靶标关系一致。RLM-5'RACE技术验证结果表明,PmmiR319a对其靶基因PmTCP2的mRNA进行了切割,切割位点位于第10和第11个碱基之间。由此可知,PmmiR319a通过调控靶基因PmTCP2影响花的发育。本研究结果为阐明梅花中miR319a的功能提供了一定的理论依据。     

果梅PmKNAT2基因全长cDNA克隆及表达分析

【目的】从‘大嵌蒂’果梅中克隆PmKNAT2,并对其结构特征及表达模式进行分析,为研究果梅雌蕊败育的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中查找与果梅相似性很高的桃KNOPE2（KNAT2的同源基因）序列（EF093491）,根据桃的KNOPE2序列设计特异引物;采用改良CTAB法提取‘大嵌蒂’果梅花芽总RNA;通过RT-PCR和RACE技术获得基因cDNA序列全长;使用DNAMAN软件进行序列拼接;利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;通过生物信息学方法分析结构特征;用DNAMAN软件分析基因的ORF和氨基酸序列;MEGA4.0软件进行系统进化树的构建;利用Bioxm2.6推测分析蛋白分子量和等电点;根据NCBI中Conserved Domains程序进行蛋白质保守域结构预测;用ExPaSy提供的在线SOPMA程序进行蛋白质二级结构预测;构建PJIT166-PmKNAT2-GFP的融合亚细胞定位表达载体,采用基因枪法转化洋葱表皮细胞,经暗培养后在激光共聚焦显微镜下观察;利用实时荧光定量RT-PCR研究其表达模式,分析其在‘大嵌蒂’花芽发育不同时期、不同器官中的表达特性。【结果】在‘大嵌蒂’果梅中获得一个KNAT2的同源基因,命名为PmKNAT2,其cDNA全长为1 402 bp,5'UTR 47 bp,3'UTR 293 bp,编码区全长为1 062 bp,编码353个氨基酸,预测蛋白质分子量为40.41 kD,理论等电点为4.85。蛋白结构分析表明该基因编码的氨基酸具有2个结构域,MEINOX结构域（KNOXⅠ和KNOXⅡ 2个亚结构域）和HD（homomeodomain）结构域,属于KNOX蛋白;相似性分析发现该基因与GenBank中其它来源的KNOX蛋白序列的相似性为50%-100%;系统进化树分析显示果梅PmKNAT2与桃KNOX聚为一类,表明与其亲缘关系最近。二级结构预测结果表明PmKNAT2所编码蛋白由47.14%的α-螺旋（Alpha helix）、3.43%的β-转角（Beta turn）、3.14的β-折叠（Extended strand ）和46.29%的随机卷曲（Random coil）组成。亚细胞定位结果显示该基因编码的蛋白定位于细胞核和细胞膜中。实时荧光定量RT-PCR分析表明,在‘大嵌蒂’果梅不同时期花芽中PmKNAT2的表达量存在一定差异,PmKNAT2在11月份的表达量最高,9月、10月和11月的表达量差异不明显,但与12月和1月花芽中的表达量差异明显;生长素在1月份含量最高,9、10、11月份差异不明显,其含量变化趋势与PmKNAT2表达趋势相反。对该基因表达量最高的11月份的花芽进行实时荧光定量分析发现：PmKNAT2在各种花芽中均有表达,在不完全花（雌蕊褐色、雌蕊畸形和无雌蕊）中的表达量高于完全花（雌蕊正常）。进一步分析PmKNAT2在完全花与不完全花的不同花器官中的表达量,结果表明PmKNAT2在完全花与不完全花的各部位的表达量趋势相似均为：萼片>雄蕊>花瓣,在完全花雌蕊中的表达量最低。【结论】推测PmKNAT2在雌蕊发育阶段的异常表达可能与‘大嵌蒂’果梅雌蕊败育有关。     

吲熟酯和钼酸铵处理对青种枇杷果实糖积累及相关酶活性的影响

以青种枇杷为试材,在果实成熟前50d左右分别喷施100、200、300mg·L-1吲熟酯及0.1%钼酸铵和200mg·L-1吲熟酯+0.1%钼酸铵,研究吲熟酯和钼酸铵对果实生长发育过程中糖积累以及蔗糖与山梨醇代谢相关酶活性变化的影响。结果表明:200mg·L-1吲熟酯处理对增加果实的果糖和葡萄糖积累最为明显。所有处理的果实山梨醇含量均随果实发育呈先下降后上升的趋势。100mg·L-1吲熟酯处理的蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性在5月21日后呈明显的下降趋势,其他处理的蔗糖代谢相关酶活性均呈上升趋势;山梨醇代谢相关酶活性总体上呈下降趋势。综上所述,200mg·L-1吲熟酯处理对青种枇杷果实糖积累有较显著的促进作用。     

梅PmARF17克隆及其在花发育中与内源激素的调控模式

【目的】分析梅PmARF17的生物学功能,探究梅花发育进程中其表达丰度与内源激素动态变化的关系,为梅花发育的调控研究提供依据。【方法】以梅品种‘大嵌蒂’为试材,克隆PmARF17,利用生物信息学软件分析基因结构、系统进化及其与其他物种同源蛋白的差异;亚细胞定位确定PmARF17蛋白在细胞中作用的部位;以梅品种‘大嵌蒂’和‘龙眼’不同发育阶段的花芽、叶芽、花器官为试材,利用qRT-PCR检测PmARF17时空表达模式,通过UPLC法测定IAA、GA₃、ABA、ZT含量的动态变化,并与PmARF17的表达进行相关性分析;克隆PmARF17启动子,分析启动子的顺式作用元件,利用瞬时表达解析PmARF17与GA₃的调控模式。【结果】从梅品种‘大嵌蒂’中克隆得到PmARF17,系统进化树分析表明PmARF17蛋白与其他植物的ARF蛋白序列高度同源;亚细胞定位表明其作用于细胞核和细胞膜上;qRT-PCR表达和内源激素含量的相关性分析表明,PmARF17的表达与IAA含量的变化趋势没有明显的相关性。PmARF17在雌蕊完好花芽中的表达水平相对不完全花芽显著上调,而GA₃含量与PmARF17的表达趋势一致。ABA和ZT含量总体上与PmARF17的表达呈相反的趋势,表明两者可能抑制PmARF17的表达。PmARF17启动子含有GA顺式元件,且具有启动活性和组织表达特异性,在花瓣、雄蕊及根部特异表达。【结论】 PmARF17可能是梅花发育的正调控基因,促进梅雌蕊的正常发育。PmARF17的表达可能受到GA₃的正调控,其可能通过作用于雄蕊和花瓣,进而影响梅的雌蕊发育进程。     

杨梅组织培养研究进展

综述了近年来杨梅组织培养的研究进展,包括外植体的选取、植物生长调节剂的筛选以及培养基与培养条件选择等方面,分析讨论了组织培养过程中常见污染、褐化和玻璃化问题及其解决方法,并对杨梅组培的应用前景进行了讨论。     

青种枇杷组织培养技术初探

以芽为研究材料,对青种枇杷的组织培养技术进行了初探。结果表明:以春季3～4月采样为最佳时期;春芽用75%乙醇浸泡20～30 s后,再用0.1%升汞处理10 min效果最好;春芽在MS+1.2 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3培养基上萌动效果最好。     

枇杷果实蔗糖磷酸合酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据GenBank中已登录的多种植物的蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,从枇杷果实中扩增出该基因的cDNA片段并测序,分别为386 bp和383 bp。序列分析表明,枇杷果实蔗糖磷酸合成酶基因与桃果实蔗糖磷酸合成酶基因相似性达91%。半定量RT-PCR分析表明,该基因在枇杷果实生长发育过程中的表达量逐渐增加。所得基因片段已在GenBank中注册,386 bp和383 bp登记号分别为HM122759和HM146926。     

杨梅地方品种‘浪荡子’组培快繁体系建立

杨梅品种‘浪荡子’是优良的地方品种。本文以茎尖、茎段为材料，对‘浪荡子’杨梅进行了组培快繁技术的研究。结果表明：以春季3～5月份取样为最佳时期；外植体先用75%乙醇浸泡50～60s，再用0.1%升汞处理7min这个消毒处理组合效果最好；在WPM 0.15 mg/ L 6-BA 0.03 mg/ L NAA 1.0 g/ L PVP培养基上芽萌动和茎伸长效果最好；在WPM 1.2 mg/ L 6-BA 0.1 mg/ L NAA 0.5 mg/ LGA3 1.0 g/ L PVP培养基上新芽增殖的效果最好。     

生草对桃园土壤及桃果实品质的影响

为了研究桃园行间生草对桃园土壤和果实品质的影响,在南京农业大学白马教学园区,桃园中,分别以行间播种黑麦草和紫花苜蓿作为处理,以清耕为对照,测定不同生草模式下桃园果实品质和不同土层土壤有机质、营养元素、酶活性等指标。结果表明:2种生草处理均能改善桃园土壤状态,其中紫花苜蓿和黑麦草处理后20—40 cm土层中的土壤有机质含量分别提高了31%和40%。生草处理下果园土壤氮素有所下降,不同土层下降程度不同;但磷、钾及其他微量元素含量却显著上升,增量视草种不同而异;与清耕对照相比,黑麦草的全磷和全钾的含量上升了40%和18%,以黑麦草处理的全磷含量最高,为1.13 g/kg,以黑麦草处理的全钾含量最高,为17.31 g/kg。与清耕相比,行间生草显著增加了桃果实单果重、可溶性固形物、可溶性糖含量、V_C和可滴定酸含量,紫花苜蓿与黑麦草处理下的可溶性固形物含量分别提升了32%和16%;紫花苜蓿和黑麦草处理下的V_C含量分别提升了46%和51%;紫花苜蓿和黑麦草处理下的可溶性糖含量分别提升18.5%和11.15%;紫花苜蓿和黑麦草处理下的可滴定酸含量分别提升了29%和37%,以黑麦草处理的可滴定酸含量最高,达到0.33%。但生草对果实硬度和果形指数未见显著影响。综上所述,生草对桃园土壤的改善和桃果实品质有积极的作用。     

杨梅组织培养研究进展及存在问题

本文综述了近年来杨梅组织培养的研究进展，包括外植体的选取、植物生长调节剂的筛选以及培养基与培养条件选择等方面，分析讨论了组织培养过程中常见污染、褐化和玻璃化问题及其解决方法，并对杨梅组培的应用前景进行了讨论。