白粉菌诱导的华东葡萄环化cDNA文库中抗病基因筛选

【目的】从环化的中国华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后的叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因序列。【方法】根据植物抗病基因在氨基酸水平上的保守结构域NBS的P-loop区和LRR设计特异引物,采用三维文库筛选法,对环化的葡萄白粉菌接种诱导后的叶片cDNA文库进行PCR筛选。【结果】共建组池24个,每个组池中含有单菌落768个,包含18432个克隆。从中筛选出具有抗病基因保守序列的阳性克隆585个,其中具有NBS保守序列引物筛选出330个,LRR保守序列引物筛选出255个。对获得的阳性克隆中的插入片段进行了测序,经生物信息学分析去除重复序列后,获得422条具有抗病基因保守结构域的基因序列,其中具有NBS保守序列的250条,具有LRR保守序列的172条,共有NBS和LRR保守序列的25条。【结论】经翻译分析,其中8条编码产物包含NBS的P-loop结构域(GW787739—787742、GW787746、GW787747、GW787749、GW787758),5条编码产物包含LRR结构(GW787743、GW787744、GW787750、GW787751、GW787753),1条华东葡萄特有基因(GW787754)。从中选出具有不同抗病结构域的10条基因进行病源侵染过程中的基因实时定量表达分析,发现其中5条抗病相关基因的表达可被白粉菌接种所诱导,可能与白粉病侵染过程有关。     

琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选

【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。     

棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组文库的构建

【目的】构建棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,为研究棉花线粒体基因组结构以及棉花细胞质雄性不育的形成机理提供基础。【方法】在借鉴其它作物的线粒体基因组BAC文库构建方法的基础上,对棉花线粒体DNA的提取及其BAC文库的构建进行探索和优化,构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,并采用同源克隆的方法克隆棉花线粒体的功能基因。【结果】构建的不育系和保持系的线粒体基因组文库分别包括2 600个克隆,插入DNA片段大小在10.3 kb和37.5 kb之间,平均分别为22.29 kb和21.36 kb。重组子的覆盖率分别达到棉花线粒体基因组的79倍和76倍。获得了3个棉花线粒体功能基因序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系的这3个基因序列无差异;以这3个基因为探针筛选文库,均获得阳性克隆。【结论】分别构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的BAC文库。获得了晋A不育系与其保持系的orfB,coxⅠ和nad4L 3个基因的全序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系在orfB、coxⅠ和nad4L基因全序列上无差异。     

大麦幼穗MLOC-14401基因编码区的同源克隆和序列分析

【目的】编码区序列是基因作用机制、遗传多样性和进化关系等研究的重要资源。【方法】以盐城红茎大麦、青田红大麦、淳安六棱胭脂大麦和北青7号为材料,采用同源克隆技术分离、克隆MLOC-14401基因CDS序列,利用ORF Finder、BLAST和Clustal X等软件分析所克隆的CDS序列。【结果】MLOC-14401基因CDS序列全长1 248 bp、包含3个外显子、GC含量为62.82%,位于大麦3H染色体的609 892 778~609895 303 bp区间,起始密码(ATG)和终止密码序列(TAA)分别位于119 bp和1 366 bp位点。所编码多肽链包含415个氨基酸、2个MYB结构域,与普通小麦等9个物种的MYB基因编码多肽链具有不同程度的氨基酸序列相似性,保守序列位于105氨基酸与237氨基酸之间。【结论】MLOC-14401基因属大麦转录调控基因R2R3-MYB,所克隆的CDS序列对于大麦MYB基因作用机制等研究具有一定指导作用。     

中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区349I12 BAC克隆插入片段基因组成与结构分析

利用已测序的中国美利奴绵羊细菌人工染色体(BAC)文库MHC区段阳性克隆插入片段制备探针,筛选中国美利奴绵羊(新疆军垦型)混合组织cDNA文库,以期获得该MHC片段的基因组成与结构信息。用中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区域内的349I12 BAC克隆,BsaJⅠ酶切后制备α-32P放射性探针,以噬菌斑原位杂交筛选正常中国美利奴绵羊cDNA文库,并将分离所得的cDNA阳性克隆测序后进行基因结构分析。以349I12 BAC克隆制备探针经过两轮的噬菌斑原位杂交筛选,获得19个cDNA阳性克隆,经测序、比对等进一步分析确定获得17条不同序列,其中7条序列与免疫相关。绵羊20号染色体上的MHC区段包含表达序列,且多为断裂基因,对其基因结构的分析将有助于相应基因功能及调控方面的研究。     

控制桃粘/离核PG基因的BAC克隆筛选与序列分析

【目的】控制桃果实粘/离核性状的多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase,PG）基因存在串联重复和大片段的缺失。本研究对粘核桃所处的F-M基因座序列特征进行分析,为开发相关分子标记提供依据。【方法】本研究利用构建的粘核桃单株‘87-7-1’基因组的细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）文库,通过PCR筛选出含F-M基因座的阳性克隆,利用单分子纳米孔技术进行全长测序,并对BAC克隆中的插入片段进行基因注释、序列比对和生物信息学分析。【结果】利用已有桃品种的基因组重测序数据设计PCR引物,以BAC文库为模板,扩增F-M基因座上/下游稳定共有的序列,获得了扩增产物上/下游条带均为阳性的目标单克隆46-B-10。全长测序结果表明,BAC克隆的插入片段全长为111 612 bp,GC含量为37.03%。利用基因同源共线性方法对Prunus_persica_v2.0桃参考基因组和BAC克隆之间的同源信息进行比对分析,确定了同源区域。而与已知的桃参考基因组（测序品种为‘Lovell’,离核）序列进行比对,发现只有5个基因（Prupe.4G261700、Prupe.4G261800、Prupe.4G261900、Prupe.4G262000、Prupe.4G262500）序列能比对到该单克隆全长的区域,而‘87-7-1’在相应位置缺失了4个基因共34 kb,其中包括控制桃粘/离核的EndoPGF（Prupe.4G262200）。【结论】与桃参考基因组测序品种‘Lovell’相比,粘核桃单株‘87-7-1’的F-M基因座缺失了EndoPGF,只有EndoPGM,本研究明确了粘核桃F-M基因座的结构变异情况,为粘/离核性状分子标记的开发奠定了基础。     

短枝型苹果SSH文库构建及相关基因表达分析

【目的】寻找苹果短枝型枝条形成相关基因,为进一步探索苹果短枝型芽变形成机理及选育新的短枝型苹果品种奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术构建正反向苹果短枝型芽变枝条和正常型枝条差异表达cDNA文库,利用荧光定量RT-PCR验证文库中克隆的插入片段。【结果】从两个文库中共获得291个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在300—600 bp之间。利用GenBank的BLAST比对分析,其中126个表达序列标签（EST）找到了与之匹配的同源序列。获得的cDNA片段功能涉及代谢、转录、胁迫响应、转运、光合和信号转导;有165个EST片段未找到同源序列。对文库中EST序列进行实时荧光定量RT-PCR验证,结果显示这些EST序列在短枝型芽变枝条与正常型枝条之间差异性表达。【结论】通过构建短枝型苹果正反向文库,得到一些与短枝型苹果枝条节间长度相关联的基因,这些基因可能对短枝型苹果枝条的伸长具有一定作用。     

奶牛瘤胃微生物BAC文库中ACCase基因的筛选与生物信息学分析

 【目的】从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选含乙酰CoA羧化酶(ACCase)基因的克隆子,并对其全长测序和生物信息学分析。【方法】利用PCR序列驱动筛选法,从瘤胃微生物BAC文库中筛选ACCase基因,鸟枪法测定基因序列后,进行基因注释、比对和系统发育分析。【结果】筛选得到了含ACCase基因的克隆(U12),其插入片段序列(URE12)全长43 358 bp,GC含量为43.75%,经GeneMark程序预测含有38个基因,经Signature程序预测属于变形菌门。ACCase基因(Acc-32)编码159个氨基酸,与Elusimicrobium minutum的ACCase基因具有41%的相似度,编码蛋白分子量为17.89 kD,等电点为5.27,在距离Acc-32上游的33 kb区域,发现一段能编码ACCase连接酶的基因。Acc-32的结合位点氨基酸残基为GQVICVIEAMKVFNELKA,系统发育分析表明Acc-32属于ε-变形菌纲。【结论】得到了含有ACCase基因的序列片段,并且ACCase基因具有新的结构特征。     

福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良早期生长板消减cDNA文库的构建

 【目的】为应用cDNA芯片技术筛选肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)时序性差异表达基因,本研究构建了早期生长板消减 cDNA文库。【方法】将7日龄AV肉鸡随机分为两组,对照组(control,C)饲以基础日粮,试验组(thiram diet-fed,T)饲以基础日粮添加福美双100 mg?kg-1,2 d后继续饲以基础日粮,诱发肉鸡TD。应用抑制消减杂交技术(SSH)构建正反向消减cDNA文库,用PCR验证两个文库中克隆的插入片段,随机抽取100个阳性克隆测序,对所测序列同源性分析和功能预测。【结果】从两个文库共获得2 227个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在200—1 000bp之间;所测序列中有97条ESTs与GenBank中的鸡基因序列同源性达到99%,且非冗余度达到68.7%;此外,有3条ESTs未找到同源序列。这些基因具有构成细胞外基质,参与软骨内骨化和骨的重构,调节骨发育,行使信号转导、血管发生,参与电子传递及能量代谢等功能。【结论】成功构建了消减 cDNA文库,将为进一步点制cDNA芯片,筛选不同阶段的差异表达基因奠定了基础,也为肉鸡TD机理研究提供新线索。     

金荞麦二氢黄酮醇4-还原酶基因（FdDFR1）的克隆及序列分析

 【目的】克隆金荞麦二氢黄酮醇4-还原酶基因（FdDFR1）,分析其序列特征。【方法】利用同源克隆的原理,采用RACE结合cDNA文库筛选的方法,从金荞麦cDNA文库中克隆DFR基因（FdDFR1）;对其序列进行生物信息学分析和Southern杂交检测。【结果】克隆到一个DFR蛋白基因（FdDFR1）,通过Southern杂交分析,推测在金荞麦基因组中DFR基因是1～2个基因的小家族,FdDFR1是单拷贝基因;FdDFR1基因编码一个长341个氨基酸的蛋白质,在N端存在一个NADP结合位点“VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY”,还存在一个底物结合特异性决定的氨基酸基序“TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV”。【结论】首次从金荞麦中克隆到类黄酮代谢的中期关键酶基因（FdDFR1）,它具有DFR同源基因的典型特征。     

小麦细胞分裂素氧化/脱氢酶基因（TaCKX5）的克隆及其染色体定位

【目的】克隆小麦的TaCKX基因并对其序列进行生物信息学分析,明确TaCKX基因在小麦基因组中的分布情况,以期为今后深入研究小麦CKX基因以及利用该基因进行小麦重要农艺性状的遗传改良奠定基础。【方法】采用同源克隆结合BAC文库筛选的方法克隆基因,通过小麦缺体-四体对其进行染色体定位。【结果】从普通小麦中国春中分离得到TaCKX5基因的gDNA和cDNA序列。分析表明,TaCKX5基因的开放阅读框为1 596 bp,编码531个氨基酸,含有CKX基因家族典型的功能位点FAD-binding domain,预测属于分泌蛋白,并具有糖基化位点。使用中国春缺体-四体将TaCKX5定位于小麦第三同源群。系统发育分析表明,CKX基因在植物中较为保守,禾谷类作物中直向同源的CKX基因很可能具有相似的特性与功能。【结论】分离获得了普通小麦TaCKX5基因全长,TaCKX5分布于小麦染色体3A、3B、3D上,与水稻OsCKX5基因直向同源。     

PCR-based screening of BAC clones of different chromosomes in Chinese cabbage

In this paper, taking SSR and functional gene sequence as the primers and the plasmid of first- and second-level pools of bacterial artificial chromosome (BAC) library as templates, the PCR method was used for specific clones of different chromosomes in Chinese cabbage. The results showed that the number of positive clones was 1?C11 per primer and the average number of clone was 3.9 by screening 19200 clones of BAC library using 12 pairs of SSR primers from 10 linkage groups individually, which were nearly consistent with about 3.4 times of genome coverage. Positive clones were acquired in chromosome Nos. 2 to 5 and 8 to 10 without screening with the positive clones in chromosome Nos. 1, 6, and 7. In addition, the primer of FLC1 functional gene of chromosome No. 10 was used for PCR screening, and two BAC clones containing FLC1 gene were acquired. Therefore, different specific BAC clones of chromosomes were taken by using SSR primer and functional gene primer. Specific clone screening of chromosomes could provide a probe for identifying the chromosome accurately. Meanwhile, the BAC library screening method was optimized, serving as an effective technical means for quick BAC clone screening.     

同源重组敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞的构建

 【目的】获得敲除肌肉生长抑制素（MSTN）基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建：以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5 382 bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844 bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35 d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250 μg?ml-1 G418筛选7 d,再用200 μg?ml-1 G418+2μmol?L-1 GANC维持筛选。用RT-PCR法检测转染前转染后细胞MSTN基因表达量。【结果】成功构建了对猪MSTN基因部分intron2和exon3区域进行敲除的替代型打靶载体。共得到5个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中一个细胞克隆发生了正确的同源重组。转染后细胞MSTN基因表达量明显降低。【结论】获得了敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞。     

C57BL/6和A/J两品系小鼠脾脏消减cDNA文库的构建及差异基因分析

【目的】检测健康C57BL/6和A/J小鼠常规免疫指标,构建脾脏消减cDNA文库并筛选差异表达基因,以探讨两品系小鼠对猪链球菌抗病性差异的分子机制。【方法】利用ELISA法检测血清常规免疫指标,抑制性消减杂交（suppression subtraction hybridization,SSH）技术构建8周龄小鼠脾脏差异表达基因的cDNA文库。【结果】试验结果表明,A/J品系小鼠血清中IgA水平明显高于C57BL/6品系小鼠（P＜0.05）,而血清IgG和IFN水平在两品系小鼠间均无显著差异。对筛选的149个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后获得56条差异表达序列标签（ESTs）。利用Genebank的BLAST分析核酸和蛋白质同源性比较,26个不同的基因或ESTs具有高度的同源性,2条ESTs未找到同源序列。【结论】筛选到很多EST与信号转导、细胞凋亡及免疫等重要功能基因高度同源,为研究猪链球菌的致病机理和防治提供了实验依据。