PCR-DGGE指纹技术与分离技术结合筛选藏灵菇奶发酵过程的优势菌

【目的】获得藏灵菇发酵奶发酵过程的优势菌，并开发出纯培养发酵剂替代藏灵菇进行这类新型发酵奶的工业化生产。【方法】将PCR-DGGE指纹技术和传统培养方法结合，对藏灵菇发酵奶中微生物种群结构进行研究。【结果】DGGE指纹图谱显示混合菌群中细菌有4条条带无对应的纯菌株，而纯菌株中有2株在混合菌群的图谱上没有相应的条带。通过对150株分离菌的PCR-DGGE指纹图谱分析，获得了8组乳酸菌和5组酵母菌，进一步的序列分析和相似性比较，确立了藏灵菇发酵奶中的优势菌为肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌、开菲尔乳杆菌、干酪乳杆菌和克鲁维酵母，单孢酵母、啤酒酵母、假丝酵母发酵后期成为优势菌。【结论】本研究建立了一种基于分子生态的微生物高效筛选技术，为藏灵菇纯培养发酵剂的开发提供了理论依据及丰富的菌种资源。     

应用PCR-DGGE指纹技术研究真空包装火腿切片贮藏过程中的微生物动态变化

应用16S rDNA变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱和系统发育分析方法,揭示了火腿切片在真空包装、4 ℃贮藏条件下主要微生物的动态变化.直接从火腿中提取总的细菌DNA,用巢式PCR和降落PCR扩增16S rDNA V3可变区序列,再通过DGGE得到动态变化指纹图谱.DGGE图谱表明,产品在贮藏初期具有丰富的微生物群落,说明污染微生物的多样性,但经过一段时间后,只有少数种类细菌存活并最终成为主导菌群.DGGE优势条带经DNA序列分析表明,代表最相似菌为清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)和弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus),其次是长膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和非培养的明串珠菌(uncultured Leuconostoc).     

西藏开菲尔粒中酵母菌的分离与初步鉴定

西藏开菲尔粒(俗称藏灵菇)是由多种乳酸菌(间或少量醋酸菌)和酵母菌共生而成一种外形酷似菜花的白色或乳黄色团状聚合体,是目前已知的唯一可用于酸奶制作的天然野生菌种资源。采用扫描电镜、分离培养、26S rRNA基因测序与序列分析、荧光原位杂交(FISH)相结合的技术方法,对西藏开菲尔粒中的酵母菌进行了分离培养、鉴定和形态观察。结果显示:西藏开菲尔粒中酵母菌多为球形(2.0~5.0μm)或椭圆形(1.0~3.0×2.0~4.0μm);从西藏开菲尔粒中分离出的16株酵母菌分属于酿酒酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、亚罗酵母属(Yarrowia)这3个属中的4个种,其中3株是酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae),8株为马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus),3株为解脂亚罗酵母菌(Yarrowia lipolytica)。     

绿萝叶腐病病原菌16S rDNA序列的克隆与分析

为绿萝叶腐病病原菌菌株LR12的分子鉴定和应用研究提供参考,利用PCR法克隆其16S序列,并借助生物信息学方法进行分析,明确其16S rDNA序列特征。结果表明:以YFUP/YFDN为PCR引物,扩增到大小约为1 700bp的条带;LR12的16S rDNA全长为1 551bp,GC为53.9%;LR12与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的16S rDNA相似性最高,达100%,与巴西亚种的相似性次之,为99.9%,两者存在2个碱基的差异;15种细菌在发育树上可分为5组,其中LR12与胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种的关系最近,处于同一分支,支持率达100%,并与其他2种果胶杆菌属细菌聚在同一组。     

基于定量PCR方法初步分析西藏开菲尔粒中细菌与酵母菌数量变化

运用实时荧光定量PCR方法分析西藏开菲尔粒中细菌与酵母菌的数量变化规律,需要有效提取其微生物总基因组DNA。本文通过同时添加溶菌酶与溶壁酶优化实验方案,成功获得西藏开菲尔粒中微生物的总基因组DNA。荧光定量PCR分析提取自培养1、4、8和12周的西藏开菲尔粒的微生物总基因组DNA,结果显示:4个时间点细菌16S rRNA与酵母菌26S rRNA基因拷贝数均分别约为每微升107拷贝与105拷贝,表明细菌与酵母菌的数量相对稳定。该结果为进一步研究西藏开菲尔粒中细菌与酵母菌间的共生关系奠定了一定的基础。     

用PCR-DGGE和16S rDNA测序解析吐温对绵羊瘤胃细菌多样性的影响

选取装置永久性瘤胃瘘管的中国美利奴绵羊,采用5×5拉丁方试验设计,在绵羊日粮中分别添加5或10 g/d Tween 20,3或6 g/d Tween 80,以空白为对照,采用PCR-DGGE技术研究不同水平的非离子表面活性剂Tween 20和Tween 80对绵羊瘤胃中细菌多样性的影响;对DGGE指纹图谱中的12个优势DNA条带的16S rDNA进行测序和序列分析,在线寻找其相似的细菌分类。结果显示,5个组之间DGGE指纹图谱的相似性在65.4%～75.4%。与对照组相比,除10 g/d吐温20组外,其他各组的细菌丰度均有不同程度的下降。DNA序列分析表明,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA序列中有8个条带序列与GenBank中已知序列的相似性大于97%。受吐温20影响的细菌与Microbacteriumoxydans、Schlegelella aquatica、Brevundi monas sp.、Lachnospir-aceae和Methylobacillus sp.有较高的相似性;而受吐温80影响的细菌与Schlegelella aquatica、Acinetobacter soli和Microbacteriumoxydans有较高的相似性。日粮中添加吐温20和吐温80后,高剂量的吐温20使绵羊瘤胃中的优势菌种类增加,吐温80和低剂量的吐温20使优势菌种类下降。在绵羊瘤胃细菌中,受吐温20和吐温80影响的种类不同。     

尖峰岭热带雨林土壤中可培养芽胞杆菌多样性分析

采用热处理法从海南省尖峰岭热带雨林土壤中分离出164株芽胞杆菌,运用16S rDNA PCR-RFLP与序列分析技术对所得菌株进行遗传多样性分析。根据16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱的UPGMA聚类分析,在相似性为100%的水平上,分离到的164株芽胞杆菌分属于23个酶切类型,显示出丰富的遗传多样性。16S rDNA序列分析结果表明,这些菌株主要分布于Bacillus(52%)、Paenibacillus(36%)、Lysinibacillus(4%)、Brevibacillus(4%)和Psychrobacillus(4%)5个属,其中优势属为Bacillus;有6株芽胞杆菌的16S rDNA序列与数据库中相应模式菌株的最大相似性为98.3%~99.0%,可能为潜在的芽胞杆菌新种资源。     

西藏开菲尔粒中Lactobacillus kefiri的分离与鉴定

我们的前期工作表明Lactobacillus kefiranofaciens是西藏开菲尔粒中的优势菌株,约占乳酸菌总数的95%。本文通过分离纯化,结合16S rRNA基因测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、菌落PCR和显微镜观察等手段分析了开菲尔粒中的非优势乳酸菌。结果显示,Lactobacillus kefiri存在于西藏开菲尔粒中,其细胞形态呈短杆状(0.8-1.5 x 0.6-0.7μm),比Lb. kefiranofaciens短,且细菌聚集生长的趋势更为明显。鉴于西藏开菲尔粒的外表面结构相对紧实,推测Lb. kefiri主要分布在其外表面。     

应用变性梯度凝胶电泳和16S rDNA序列分析对山羊瘤胃细菌多样性的研究

 以取自3头安装有永久性瘤胃瘘管的土种山羊的瘤胃内容物为材料, 经过DNA抽提和PCR扩增, 扩增产物利用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE，一种DNA指纹技术)分析瘤胃细菌在两种日粮条件下的多样性。同时利用基因序列分析技术，分析了16个在DGGE胶上有匹配带的克隆的16S rDNA序列，并与现有的数据库进行了比较。结果表明，饲喂基础日粮时3头山羊瘤胃内容物的DGGE图谱有一定的相似性(43%～55%)；饲料中添加大豆黄酮一定程度上影响了瘤胃细菌的组成，DGGE谱带变化程度分别为1号36%、2号46%、3号30%。基因序列分析表明，DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有5个基因序列与基因数据库登录的相关序列的相似性大于97%，8个基因序列的相似性在90%～96%，余下的低于90%。相似性大于97%的5个克隆中，只有1个被鉴定为Prevotella sp.，其余4个都属于未被鉴定的瘤胃细菌。     

海鲜菇栽培料中细菌菌落结构及多样性分析

采用高通量测序技术研究海鲜菇栽培料中的细菌群落多样性、微生物群落组成,结果表明,海鲜菇栽培料细菌16S rDNA的V3～V4区测序共获得52 192条序列,10 588个OTU数目,栽培料中具有较多的微生物群落;群落中,变形菌门占92.71%,γ-变形菌纲占75.77%,假单胞菌目占69.76%,莫拉氏菌科占68.73%,不动杆菌属占66.30%。     

藏系绵羊瘤胃古菌季节动态分析

在不同季节分别随机选取3只藏系绵羊,采用PCR-DGGE技术对12只藏系绵羊瘤胃内容物中的细菌区系进行分子生态学分析.对古菌16SrDNA的V2～V4可变区的扩增产物进行DGGE图谱分析、相似性分析和Shannon多样指数分析.结果表明:瘤胃内容物中古菌群落多样性指数冬季与春季间差异不显著(P>0.05),但冬季显著高于夏季(P<0.05),并极显著高于秋季(P<0.01);春季与夏季差异不显著(P>0.05),春季显著高于秋季(P<0.05);夏、秋季之间差异不显著(P>0.05).各季间瘤胃古菌区系组成结构相似性高于94%.冬、春季节,由于牧草中的纤维性物质含量增高,导致瘤胃古菌群落多样性增加,不同季节牧草中粗蛋白和酸性洗涤纤维含量的变化可以引起特异性的古菌群落发育,可能导致不同的优势种群.     

开菲尔粒中优势菌的筛选及鉴定

[目的]筛选开菲尔粒中的优势菌系,为研究其共生机理以及开发新产品奠定基础。[方法]首先,将开菲尔颗粒粉碎,制备成不同稀释浓度的菌悬液,涂布于麦芽汁、PDA、MRS和改良的TJA培养基上。然后,在30℃和37℃条件下,分别在有氧和厌氧条件下培养7 d,挑选菌落,进行形态观察和生理生化试验。[结果]分离得到9株酵母菌和9株乳酸菌。其中克鲁维酵母属2株,假丝酵母属3株,酒香酵母属4株,肠膜明串珠菌葡聚糖亚种1株,乳酸乳球菌乳脂亚种2株,高加索酸奶乳杆菌3株,瑞士乳杆菌1株,德氏乳杆菌保加利亚亚种1株,德氏乳杆菌乳亚种1株。[结论]开菲尔粒中共有18株优势菌,包括9株酵母菌,3株乳酸球菌和6株乳酸杆菌。     

开菲尔粒中一株醋酸菌的分离鉴定

[目的]从开菲尔粒中分离并鉴定醋酸菌,为研究醋酸菌在开菲尔饮品发酵及开菲尔粒形成机理提供理论及技术基础。[方法]将开菲尔粒粉碎后制备成不同稀释浓度的菌悬液,涂布于筛选培养基上,37℃条件下培养7d,挑选单菌落进行形态观察、生理生化试验,并扩增其16SrRNA基因,测序鉴定。[结果]筛选到一株醋酸菌——KAB7。[结论]根据该菌形态观察、生理生化试验结果以及16SrRNA测序比对,鉴定为巴氏醋杆菌巴氏亚种。     

开菲尔对小鼠血清胆固醇水平的影响

开菲尔是一种饮用历史悠久的功能性发酵乳制品,为探讨开菲尔对小鼠血清胆固醇水平的影响,将小鼠随机分成3组:对照组、高脂模型组和开菲尔组。对照组饲喂基础饲料,高脂模型组和开菲尔组饲喂高脂饲料,开菲尔组每日灌胃开菲尔发酵乳,对照组和高脂模型组给予无菌蒸馏水,连续灌胃28 d。结果表明,开菲尔组与高脂模型组相比,小鼠血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量明显降低(P<0.05),而血清总甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量无显著差异(P>0.05),动脉粥样硬化指数(AI)极显著降低(P<0.01),抗动脉粥样硬化指数(AAI)极显著升高(P<0.01)。由此可知,开菲尔能有效降低实验性高胆固醇血症小鼠的血清胆固醇水平。     

混料设计在藏灵菇奶纯培养发酵剂配方设计中的应用

 【目的】寻求藏灵菇奶纯培养发酵剂中各组分的最佳组合。【方法】采用混料设计研究了发酵剂中5种菌种的不同组合对发酵奶风味成分的影响,建立各菌种在混合发酵剂中配比与发酵的主要代谢产物之间的回归模型,考查配方中各组分的互作效应。【结果】分析得出乳酸的最大预测值为8.16 g•L-1;丁二酮的最大预测值为77.23 mg•L-1;乙醇的最大预测值为4 259 mg•L-1;二氧化碳的最大预测值为2.12 g•L-1。对满足所有期望的响应值的条件进行优化,获得藏灵菇奶纯培养发酵剂的最优组合为乳酸乳球菌（27%）、明串珠菌（37%）、开菲尔乳杆菌（11%）、干酪乳杆菌（10%）、克鲁维酵母（15%）。【结论】混料设计和调优软件可用于混合发酵剂中多组分和多目标参数优化,获得最优的发酵剂组合。     

Kefir粒发酵人参米酒工艺的优化

以大米糖化液和人参浆液为主要原料,通过Kefir粒发酵酿造Kefir人参米酒。以乙醇体积分数(酒精度)和感官评价分数为响应值,使用Box-Behnken Design方法对糖化酶添加量、人参浆液添加量、Kefir接种量进行优化,得到Kefir粒发酵人参米酒最佳工艺条件。结果表明:糖化酶添加量是显著影响(P0.05)米酒酒精度的因素,人参浆液添加量是影响米酒感官评价的显著因素(P0.05)。Kefir粒发酵人参米酒最佳工艺条件:糖化酶添加量0.8%、Kefir接种量10%、人参浆液添加量20%,发酵15 d后乙醇体积分数(酒精度)为13%,米酒感官评价为93分。该优化条件下人参总皂苷含量提高了18.6%。     

开菲尔粒中发酵优势菌混合发酵生产开菲尔饮品的研究

[目的]考察各菌株对酸乳各项发酵指标的影响,为开发稳定的开菲尔饮品生产工艺提供理论基础。[方法]采用从开菲尔粒中筛选获得的6株优势菌进行单菌及混合发酵,以1×104个/ml的接种量,分别接种单菌或多种菌以等比例混合至新鲜牛奶中,30℃培养30 h后于4℃储存10 h,测定各项发酵指标。[结果]利用2种菌混合发酵过程中,高加索乳杆菌与德氏乳杆菌混合发酵所得的酸乳风味最佳,高加索乳杆菌与肠膜明串珠菌混合发酵和肠膜明串珠菌与克鲁维酵母混合发酵的风味较好。3种菌混合发酵过程中,利用克鲁维酵母、乳酸乳球菌和肠膜明串珠菌混合发酵所得的酸乳风味最佳,利用假丝酵母、乳酸乳球菌和肠膜明串珠菌混合发酵以及利用克鲁维酵母、高加索乳杆菌和德氏乳杆菌进行发酵所得的酸乳风味较好。[结论]利用酵母菌和乳酸菌混合发酵能有效提高牛奶中脂肪的降解率,但是抑制发酵乳中芳香物质的产生。2种菌混合发酵条件下所得酸乳的乳酸含量及黏度显著高于3种菌混合发酵,这可能与菌的共生过程中各菌的生长、代谢之间的相互作用有关。     

藏灵菇发酵乳中乳杆菌的分离与鉴定

从藏灵菇发酵乳中分离益生乳杆菌,研究其生理生化特性,为功能性乳制品的开发提供优良菌种.先用乳酸菌分离培养基MRS从藏灵菇发酵牛乳中分离得到乳酸菌,再分离纯化出乳杆菌,并对分离的乳杆菌进行生理、生化鉴定,研究其生长特性.结果表明,用MRS培养基从藏灵菇发酵牛乳中共分离出乳杆菌菌株6株,通过生理生化试验确定这6抹分别为：2株发酵乳杆菌、2株嗜酸乳杆菌和2株短乳杆菌.将分离出的菌发酵鲜牛乳,在品尝过程中发现口感较酸,推断其有很强的产酸能力.     

新疆沙尘暴源区塔克拉玛干空气真菌群落的T-RFLP分析

[目的]了解新疆塔克拉玛干沙漠周边地区空气真菌物种多样性及群落结构特征.[方法]应用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术分析和比较塔克拉玛干沙漠空气真菌多样性.[结果]塔克拉玛干沙漠周边且末地区的空气真菌物种多样性最高,尉犁地区最少,9个地区空气样品间相似性介于8.3;～41.9;,其中若羌和莎车地区的相似性最高,达到41.9;;尉犁地区与且末、叶城的相似性最低,为8.3;,与聚类分析结果大体上相一致.典型性相关分析(CCA)表明非生物环境因子(海拔、温度、风速等)影响空气真菌群落的多样性.[结论]塔克拉玛干沙漠周边9个地区空气真菌多样性较丰富,且各地区的优势真菌种群和丰度不同;限制性内切酶的种类对空气真菌群落信息的描述有较大影响.