PCR-DGGE指纹技术与分离技术结合筛选藏灵菇奶发酵过程的优势菌

【目的】获得藏灵菇发酵奶发酵过程的优势菌，并开发出纯培养发酵剂替代藏灵菇进行这类新型发酵奶的工业化生产。【方法】将PCR-DGGE指纹技术和传统培养方法结合，对藏灵菇发酵奶中微生物种群结构进行研究。【结果】DGGE指纹图谱显示混合菌群中细菌有4条条带无对应的纯菌株，而纯菌株中有2株在混合菌群的图谱上没有相应的条带。通过对150株分离菌的PCR-DGGE指纹图谱分析，获得了8组乳酸菌和5组酵母菌，进一步的序列分析和相似性比较，确立了藏灵菇发酵奶中的优势菌为肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌、开菲尔乳杆菌、干酪乳杆菌和克鲁维酵母，单孢酵母、啤酒酵母、假丝酵母发酵后期成为优势菌。【结论】本研究建立了一种基于分子生态的微生物高效筛选技术，为藏灵菇纯培养发酵剂的开发提供了理论依据及丰富的菌种资源。     

淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽发酵培养基及发酵条件的优化

 【目的】提高淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）发酵产脂肽类抗菌物质的产量。【方法】采用Plackett-Burman Design对影响B. amyloliquefaciens ES-2-4产脂肽类抗菌物质产量的13个因子进行筛选,在筛选结果的基础上,再运用Uniform Design（均匀设计）对关键因子的最佳水平范围进行研究,通过回归方程求解得到最高产量时各关键因子的最优组合。【结果】影响抗菌物质产量的关键因子为葡萄糖、L-谷氨酸钠、转速和温度;获得最佳产量时关键因子的最优组合为：葡萄糖(42 g•L-1)、L-谷氨酸钠(14 g•L-1)、温度（27℃）、转速（200r/min）,在此条件下,产量从优化前的4.84 g•L-1 提高到了6.76 g•L-1,增长了39.7%。【结论】B. amyloliquefaciens ES-2-4抗菌脂肽发酵培养基筛选与优化的过程中,采用Plackett-Burman Design和Uniform Design相结合的方法,效果显著,经济有效。     

富含L-乳酸黑米发酵饮料的研制及发酵工艺的优化

以黑米为原料,通过高产L-乳酸发酵剂的筛选,并采用二次正交旋转回归组合设计优化富含L-乳酸黑米发酵饮料的发酵工艺参数.研究结果表明,保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌(1∶1)菌种为最佳发酵剂,发酵技术为:黑米酶解液中添加6%的大豆分离蛋白,发酵剂3%,43.5℃恒温发酵9 h.成品L-乳酸含量达到9.00 mg·mL-1,感官综合的评分88分.     

RP-HPLC同时检测苹果汁中乳酸、富马酸、5-HMF和展青霉素

 【目的】同时定量检测苹果汁中乳酸、富马酸、5-HMF和展青霉素,建立一种基于多通道紫外检测器的反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离方法。【方法】采用C18色谱柱（250 mm×4.6 mm ID,5.0 μm）,以pH为2.5的磷酸水溶液和乙腈按95:5混合为流动相,在流速1.00 ml•min-1,温度30℃下进行乳酸、富马酸、5-HMF和展青霉素的色谱分析。【结果】前10 min,两种有机酸在210 nm下被分离和检测;后10 min,5-HMF和展青霉素于276 nm下被分离和检测。检测限分别为: 乳酸0.1790 mg•L-1、富马酸0.0032 mg•L-1、5-HMF 0.0057 mg•L-1和展青霉素0.0089 mg•L-1,保留时间、峰高和峰面积的重现性（n=3）变异系数（CV）均小于1.0%。保留时间的日内重现性（n=3）和日间精密度（n=10）变异系数（CV）分别小于0.09%和0.5%。平均回收率为95.64%～99.17%。【结论】该方法可应用于同时定量检测苹果浓缩汁中乳酸、富马酸、5-HMF和展青霉素。     

鼠李糖乳杆菌产细菌素条件优化及抑菌活性研究

【目的】为提高分离自藏灵菇的鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的能力，对其产细菌素的发酵条件进行优化，并分析其抑菌活性。【方法】采用单因素试验，分析鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的最适发酵条件，即发酵时间、温度、培养基初始pH值、接种量等4个因素对其产细菌素能力的影响，在此基础上利用Box-Behnken法设计四因素三水平正交试验进行响应面优化，利用优化条件提取细菌素并对大肠杆菌进行抑菌试验。【结果】响应面法优化的鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的最佳发酵条件为发酵时间20 h、发酵温度35 ℃、培养基初始pH 6.5、接种量2.5%(体积比)，此时细菌素的相对效价为（242.02±10.24） AU/mL，比优化前的相对效价（118.40±10.36） AU/mL提高了104.41%。获得的发酵上清液用乙酸乙酯萃取浓缩，作用于大肠杆菌指示菌和鼠李糖乳杆菌zrx01 8 h，鼠李糖乳杆菌zrx01不产生抑菌圈，而大肠杆菌抑菌圈明显。扫描电镜显示，该细菌素对鼠李糖乳杆菌zrx01自身无作用，但可使大肠杆菌的菌体表面形成孔洞，从而抑制大肠杆菌的生长。【结论】分离自藏灵菇中的鼠李糖乳杆菌zrx01所产细菌素，在食品防腐方面具有很好的应用前景。     

藏灵菇发酵乳中乳杆菌的分离与鉴定

从藏灵菇发酵乳中分离益生乳杆菌,研究其生理生化特性,为功能性乳制品的开发提供优良菌种.先用乳酸菌分离培养基MRS从藏灵菇发酵牛乳中分离得到乳酸菌,再分离纯化出乳杆菌,并对分离的乳杆菌进行生理、生化鉴定,研究其生长特性.结果表明,用MRS培养基从藏灵菇发酵牛乳中共分离出乳杆菌菌株6株,通过生理生化试验确定这6抹分别为：2株发酵乳杆菌、2株嗜酸乳杆菌和2株短乳杆菌.将分离出的菌发酵鲜牛乳,在品尝过程中发现口感较酸,推断其有很强的产酸能力.     

气相色谱电子捕获法测定氟啶胺在辣椒和土壤中动态残留

 【目的】建立辣椒和土壤中氟啶胺残留的分析方法,探明氟啶胺在辣椒田中使用后的残留行为,为安全施药提供依据。【方法】采用田间试验法研究氟啶胺在辣椒和土壤中的残留消解动态。【结果】氟啶胺在辣椒中半衰期为2.5～3.7 d,土壤中为1.2～4.2 d。使用氟啶胺50%悬浮剂,制剂用量为495 g•ha-1。（有效成分247.5 g•ha-1）,施药4次, 距末次施药后7 d收获的辣椒中氟啶胺残留量小于0.06 mg•kg-1,低于韩国规定的最大残留限量值（0.3 mg•kg-1）。【结论】该分析方法操作简单,精密度、准确度和灵敏度都符合农药残留标准要求,适用于辣椒和土壤中的氟啶胺残留测定;建议氟啶胺50%悬浮剂在辣椒上防治病害,最多使用4次,用量为247.5～495 g•ha-1（有效成分123.75～247.5 g•ha-1）,安全间隔期为7 d。     

鼠李糖乳杆菌产细菌素条件优化及抑菌活性研究

【目的】为提高分离自藏灵菇的鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的能力,对其产细菌素的发酵条件进行优化,并分析其抑菌活性。【方法】采用单因素试验,分析鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的最适发酵条件,即发酵时间、温度、培养基初始pH值、接种量等4个因素对其产细菌素能力的影响,在此基础上利用Box-Behnken法设计四因素三水平正交试验进行响应面优化,利用优化条件提取细菌素并对大肠杆菌进行抑菌试验。【结果】响应面法优化的鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的最佳发酵条件为发酵时间20h、发酵温度35℃、培养基初始pH 6.5、接种量2.5%(体积比),此时细菌素的相对效价为(242.02±10.24)AU/mL,比优化前的相对效价(118.40±10.36)AU/mL提高了104.41%。获得的发酵上清液用乙酸乙酯萃取浓缩,作用于大肠杆菌指示菌和鼠李糖乳杆菌zrx018h,鼠李糖乳杆菌zrx01不产生抑菌圈,而大肠杆菌抑菌圈明显。扫描电镜显示,该细菌素对鼠李糖乳杆菌zrx01自身无作用,但可使大肠杆菌的菌体表面形成孔洞,从而抑制大肠杆菌的生长。【结论】分离自藏灵菇中的鼠李糖乳杆菌zrx01所产细菌素,在食品防腐方面具有很好的应用前景。     

Lactobacillus casei AST18抗真菌特性及其在酸奶保鲜中的应用

 【目的】考察来源于中国传统发酵制品中乳酸菌的抑真菌特性,研究其在酸奶贮藏中的抑制霉菌效果。【方法】高效液相色谱法（HPLC）检测7株具有抗真菌效果的乳杆菌发酵液中苯乳酸（PLA）含量,研究PLA与乳杆菌发酵液抗真菌活性的相关性。选取抑菌活性最强的菌株Lactobacillus casei AST18进行抑菌特性研究。Lactobacillus casei AST18分别以2%、4%、6%、8%接种量作为辅助发酵剂添加至酸奶发酵工艺中,成品酸奶贮藏期间,监测酸奶中霉菌生长状况,检测酸奶理化指标并进行感官评定。【结果】乳杆菌发酵液中苯乳酸含量与其抑真菌直径间相关关系不显著。Lactobacillus casei AST18发酵上清液经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后不影响其抑菌活性,而环境pH对其抑菌活性的影响显著,热处理可使其丧失抑菌活性。Lactobacillus casei AST18以 2%添加量作为辅助发酵剂应用在酸奶中可抑制霉菌菌丝生长和孢子生成,且对酸奶产品风味、感官品质无显著影响。【结论】Lactobacillus casei AST18具有较好的抑制霉菌生长能力,应用在酸奶中具有显著的防霉保鲜效果。     

转录因子ABP9转化大豆（Glycine max L.） 及遗传转化条件优化

【目的】将抗逆相关转录因子ABP9基因导入大豆(Glycine max L.)基因组,并对转化系统条件进行探索,为提高大豆遗传转化效率提供依据。【方法】以农杆菌介导的半种法大豆遗传转化系统为基础,对目的基因进行转化;以健康外植体获得率、抗性丛生芽获得率和抗性芽伸长比率为指标,对转化系统条件进行优化。【结果】共培养时保证充足的光照和氧气,外植体生长情况最好;在共培养或诱导丛生芽培养基中加入600 mg•L-1的L-半胱氨酸可以使抗性丛生芽获得率由22.1%提高至32.6%;采用4种植物激素进行正交试验,诱导抗性芽伸长比率最高的激素配比为：6-BA为1.5 mg•L-1,GA3为0.75 mg•L-1,IAA为0.1 mg•L-1,ZT为1.0 mg•L-1。【结论】利用优化的方法进行遗传转化研究已获得转基因再生植株,经PCR和DNA测序等分子检测,证明目的基因ABP9已导入并整合到大豆基因组中;转化率为1.33%。     

Application of the Mixture Design to Design the Formulation of Pure Cultures in Tibetan kefir

To obtain the optimization formulation of pure cultures in Tibetan kefir, the influence of the different mixtures of five strains in the pure cultures in Tibetan kefir on the flavor components in fermented milk was studied using the mixture design. The regression model on microorganism composition and main metabolites was established. The results suggested that the predictable production of lactate reached the maximum of 8.16 g L-1, while the most predictable production of diacetyl, ethanol, and CO2 were 77.23 mg L-1, 4259 mg L-1, and 2.12 g L-1, respectively. Based on these, the response values that satisfied all expectations were optimized, and the most excellent combination was Lactococcus lactis 27%, Leuconostoc mesenteroides 37%, Lactobacillus kefiri 11%, Lactobacillus casei 10%, and Kluyveromyces rnarxianus 15%. With the aid of analysis software （Design-expert 6.0.5）, the formulation of pure cultures in Tibetan kefir can be optimized for several responses and the best formulation can be obtained.     

产虾青素菌株CHU-R的鉴定及其培养条件优化

【目的】对产虾青素菌株CHU-R进行鉴定,并对其培养条件进行优化,为虾青素的规模化生产奠定基础。【方法】对产虾青素菌株CHU-R进行形态、生理生化及16S rDNA序列鉴定;以菌株CHU-R菌体生物量和虾青素产量为考察指标,对CHU-R菌株的碳源、氮源、微量元素等培养基成分及温度、初始pH值、接种量、装液量、蔗糖含量等培养条件进行优化,并对优化条件进行正交试验,确定最佳的培养基组分。【结果】CHU-R为乳杆菌。CHU-R菌株培养基中的适宜氮源为铵盐和尿素;碳源为蔗糖和葡萄糖;培养基中缺少Fe²⁺不利于菌体生长和虾青素积累。CHU-R的适宜培养条件为：接种量≤50 mL/L,装液量50 mL/L,初始pH值7.0～7.5,发酵温度26～30 ℃,发酵时间48～72 h,在此条件下,菌株CHU-R菌体生物量和虾青素产量均较高。【结论】乳杆菌CHUR在优化培养条件下能够得到产量较高的虾青素,具有较好的应用潜力和经济价值。     

红枣黑斑病拮抗细菌JK1产芽孢培养基的优化

【目的】 采用响应面法对红枣黑斑病的拮抗细菌JK1培养基进行优化,提高其发酵产物中芽孢的浓度。为该菌应用提供数据。【方法】单因素实验确定培养基碳氮源物质,Plackett-Burman试验分析发酵培养基中对JK1发酵影响最重要的主要因素;运用最陡爬坡法对主要因素进行试验,获得主要因素的最适范围。通过响应面分析得到主要因素的最优水平。【结果】优化后的培养基组成为:麦芽浸粉 25.00 g/L、葡萄糖 0.57 g/L、大豆蛋白胨 12.5 g/L、NaCl 2.7 g/L、K₂HPO₄ 0.25 g/L 、MgSO₄ 0.625 g/L。【结论】在最优发酵培养基培养下,多粘类芽孢杆菌的芽孢数提高了3.4倍,达到4.92×10⁹CFU/mL。     

三种植物源杀虫剂对白星花金龟的毒力测定

[目的]筛选出对白星花金龟较理想的植物源杀虫剂.白星花金龟近几年在葡萄上造成严重危害,大量使用化学农药不但影响葡萄的品质,而且对人类健康构成隐患,与当今大力发展绿色和有机葡萄生产不协调.[方法I采用触杀和W毒两种方法,对0.3;苦参碱水剂(Mat rine)、5;天然除虫菊素乳油(pyrethrina)和0.3;印棟素乳油(Azadirachtin)三种植物源杀虫剂进行室内毒力测定,并与5;吡虫啉乳油(Imidacloprid)进行比较.[结果]四种杀虫剂对白星花金龟的胃毒毒力比触杀毒力高.各药剂对白星花金龟胃毒毒力大小排序:5;吡虫啉乳油(LC50值为5.456 mg/L)>0.36;苦参碱水剂(LC50值为10.557 mg/L)>5;天然除虫菊素乳油(LC50值为15.079 mg/L)>0.3;印棟素乳油(LC50值为23.459 mg/L),[结论]5;吡虫啉乳油可用于绿色食品生产中白星花金龟的防治,0.36;苦参碱水剂和5;天然除虫菊素乳油则可以纳人绿色和有机食品生产中对白星花金龟的综合防治措施.     

刺槐花粉生活力测定方法及贮藏特性

【目的】探索刺槐花粉生活力测定方法及其贮藏特性,为刺槐生产及育种提供参考依据。【方法】以刺槐花粉为试材,使用培养基萌发试验法测定其生活力,并研究不同浓度Ca2＋、不同贮藏条件及时间对刺槐花粉萌发的影响。【结果】刺槐花粉在琼脂8.0 g/L＋蔗糖20.0 mg/L＋硼酸2.0 mg/L的培养基中萌发率高达30.25%;适当浓度的Ca2＋能促进花粉萌发和花粉管伸长,当Ca2＋浓度为1.6×10-4mg/L时,花粉萌发率高达40.25%,花粉管伸长最快;适宜刺槐花粉贮藏的条件依次为-80℃、4℃、-23℃和常温;花粉在-80℃贮藏32d后,萌发率仍达15.30%。【结论】适合刺槐花粉萌发的培养基为：琼脂8.0 g/L＋蔗糖20.0 mg/L＋硼酸2.0 mg/L;培养基中添加低浓度外源钙能促进刺槐花粉萌发和花粉管生长;于超低温真空冷冻条件下贮藏的刺槐花粉保持活力时间更长。     

响应面法优化黄色短杆菌c-11产L-丝氨酸发酵培养基

[目的]利用响应面法对黄色短杆菌c-11发酵培养基进行优化,以提高L-丝氨酸产率.[方法]先采用Plackett - Burman实验法对发酵培养基8个因素(蔗糖、酵母膏、硫酸铵、KH2 PO4、MgSO4、生物素、VB1和碳酸钙)的效应进行评价,筛选出主要因素.之后采用最陡爬坡试验逼近主要因素(蔗糖、酵母膏和硫酸铵)的最大响应区域.在此基础上,采用Box - Behnken结合响应面法(RSM)确定主要因素的最佳水平,并通过二次方程回归分析.[结果]蔗糖浓度为83 g/L、酵母膏浓度为31 g/L和硫酸铵浓度为29 g/L时,此时模型稳定点预测值L-丝氨酸产量为22.27 g/L,验证值为22.65 g/L,预测值与验证值之间吻合较好.[结论]优化后的发酵培养基使c-11菌株的L-丝氨酸产量提高了28.11;.     

荸荠试管苗壮苗培育及小球茎再生研究

【目的】探讨荸荠试管苗壮苗方法和结球茎条件。【方法】以广西荸荠品种桂蹄1号试管苗为材料,分别进行不同蔗糖、PP333、温度等因素对荸荠试管苗壮苗及小球茎再生的影响。【结果】当6-BA偏低时（1.0 mg/L）,在不同培养基中添加30.0～120.0 g/L蔗糖,均可不同程度诱导荸荠试管苗形成小球茎,其中以30.0 g/L蔗糖的效果最好;当蔗糖浓度过高时则抑制小球茎形成。当6-BA偏高时（2.5 mg/L）,荸荠试管苗仅能诱导形成匍匐茎,而以添加80.0～100.0 g/L蔗糖的效果较好。在添加NAA和IBA条件下,不同蔗糖量均能诱导荸荠试管苗长出匍匐茎,但添加30.0～60.0 g/L蔗糖时可在匍匐茎顶端膨大形成小球茎,其中以30.0 g/L蔗糖的诱导效果最好。在含有NAA和IBA的培养基中添加适宜的PP333（0.3~1.0 mg/L）均能促进荸荠试管苗生根,并具有显著的壮苗效果,而对诱导荸荠试管结球茎数量影响不明显。在15~20℃条件下培养荸荠试管苗,添加蔗糖的培养基均未能诱导形成试管小球茎,而采用培养前20 d温度28~30℃、培养后40 d温度15~26℃条件,在培养基中添加生长素类或较低浓度6-BA时,含较低蔗糖量的培养基均能诱导较多的小球茎;当6-BA浓度较高时,仅能诱导荸荠试管苗长出匍匐茎。【结论】在MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+蔗糖30.0 g/L+琼脂粉3.5 g/L培养基中添加PP333 0.3~1.0 mg/L,均具有很好的壮苗效果。在适宜的温度条件下,添加适宜的6-BA或NAA和IBA或蔗糖（30.0　g/L）均能诱导荸荠试管苗形成小球茎。     

抗金银花白粉病菌贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株培养基及发酵条件优化

【目的】优化抗金银花白粉病菌贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株的发酵培养基及发酵条件,为其快速大量生产及进行大田生物防治提供理论依据。【方法】以贝莱斯芽孢杆菌HC-8菌株为材料,采用单因素试验和正交试验,分别优化其发酵培养基及发酵条件;结合分生孢子萌发和平板对峙试验,分析优化方案下HC-8菌株对白粉病菌分生孢子萌发的抑制效果及对尖孢镰刀菌、烟草疫霉和轮状镰刀菌的拮抗活性。【结果】HC-8菌株最适基础培养基为酵母蛋白胨培养基（YSP）;最佳培养基配方为蛋白胨5.0 g/L、酵母膏25.0 g/L、麦芽糖10.0 g/L;最佳发酵条件为温度37℃、初始pH 6.0、转速180 r/min、接种量0.100%、装液量20 mL/300 mL、培养时间48 h。优化方案下,HC-8菌株对白粉病菌分生孢子萌发的抑制率为83.15%,显著高于优化前的74.65%（P<0.05,下同）;对尖孢镰刀菌、烟草疫霉和轮状镰刀菌的抑菌率分别为60.66%、59.03%和65.32%,显著高于优化前的54.31%、55.24%和59.17%。【结论】优化后的方案可提高HC-8菌株的发酵产量,并增强对尖孢镰刀菌、烟草疫霉和轮状镰刀菌的拮抗效果及对白粉病菌分生孢子萌发的抑制效果。建立的方案可用于快速、大批量发酵HC-8菌悬液。     

广西优良珍贵树种灰木莲的组织培养

【目的】探索灰木莲组培快繁体系,为灰木莲的进一步开发和利用提供参考依据。【方法】以灰木莲盆栽苗的带芽茎段为外植体,以MS为基本培养基,通过添加不同种类、不同浓度植物生长调节剂,研究不同培养基对腋芽萌发、芽增殖及生根的影响。【结果】1~5号培养基均可以诱导灰木莲腋芽萌发,其中3号培养基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L腋芽萌发速度最快,芽的诱导率89.3%;添加KT（Kinetin,激动素）的10~13号培养基增殖系数为2.2~2.7,没有添加KT的6~9号培养基增殖系数为1.8~2.2,11号培养基 MS+6-BA 0.3 mg/L +NAA 0.05 mg/L+KT 1.0 mg/L芽的增殖系数可达2.7,为最适宜的增殖培养基;添加生长调节剂浓度在0.5 mg/L以上的17~21号培养基能诱导灰木莲组培苗生根,其中NAA浓度为0.5、1.5 、2.0 mg/L生根率分别为33.3%、45.4%、58.3%,21号培养基 1/2MS+NAA 2.0 mg/L上生根率最高。【结论】初步建立灰木莲组织培养体系,组培苗的芽诱导率和增殖率较高,苗木长势良好。