贵州鹅细小病毒感染诊断技术研究

利用鹅细小病毒贵州分离株制备琼脂扩散试验沉淀抗原,建立琼脂扩散试验方法;以该分离株免疫家兔、制备高免血清、提取IgG制备荧光抗体,建立荧光抗体检测技术;根据鹅细小病毒VP3基因设计一对引物,建立PCR检测技术;然后采用这3种技术对鹅细小病毒感染临床病例进行检测比较,结果表明,这3种诊断技术均具有较高的特异性,可用于鹅细小病毒感染的临床诊断,但以荧光抗体检测技术的敏感性最高。     

犬细小病毒病的PCR临床诊断研究

建立犬细小病毒聚合酶链式反应(PCR)检测方法,并应用于临床诊断.根据犬细小病毒基因保守序列设计一对特异性引物,扩增目的片段大小为448bp.用此引物扩增疫苗中的犬细小病毒和37份病料中的犬细小病毒,并与胶体金诊断试剂盒相对比.实验结果显示:该方法能从疫苗中和临床病料中扩增出犬细小病毒目的基因片段,与胶体金诊断试剂盒相比能克服免疫血清学诊断中的非特异性反应,具有快速、准确、灵敏度高的优点,完全适用于犬细小病毒病的临床诊断.     

猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品.通过对SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒.试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL.结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测.     

猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立猪乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,根据E基因序列,设计1对特异性引物,建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度达到10~3拷贝/μL,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠,荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。     

鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)NS1基因序列设计合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测GPV核酸的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数达到0.998;对初始模板的检出下限为30个拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与鸭瘟病毒、犬细小病毒、新城疫病毒和鹅副粘病毒均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于2%。用建立的Real-time PCR检测13例GPV感染阳性病例,GPV阳性检出率为100%。表明建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于GPV的病原检测及定量分析。     

温州市某区犬细小病毒病的发病调查与临床诊治

通过对2010～2012年发病的103例犬细小病毒肠炎的发病调查、临床诊断与治疗,分析总结温州市犬细小病毒病的快速诊断、流行特点和有效治疗措施。结果表明犬细小病毒抗原快速检测试纸在实际临床诊断中是切实可行的;该病的流行与犬的免疫状况、年龄、品种季节等因素有关;特异性疗法和补能补液在治疗过程中起关键作用。     

一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]利用SYBR Green Ⅰ荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法.[方法]根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证.[结果]建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应.检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×101 copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403％.[结论]成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测.     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

菏泽市区犬6的流行病学调查

为了获得菏泽地区导致犬细小病毒病发病的主要因素,利用准确性高、成本低、耗时少、临床上易于操作的诊断方法,通过对菏泽市3家宠物医院的88例门诊病例作为研究对象,利用临床诊断、血常规分析仪来进行血常规检查和犬细小病毒病的试剂盒CPV抗原检查试纸进行检测来确诊犬细小病毒病的发病情况。结果表明,犬细小病毒病的发病与年龄、时间、季节、免疫状况等方面的因素有密切的关系,为临床实践提供了理论依据。     

菏泽市区犬6的流行病学调查

为了获得菏泽地区导致犬细小病毒病发病的主要因素,利用准确性高、成本低、耗时少、临床上易于操作的诊断方法,通过对菏泽市3家宠物医院的88例门诊病例作为研究对象,利用临床诊断、血常规分析仪来进行血常规检查和犬细小病毒病的试剂盒CPV抗原检查试纸进行检测来确诊犬细小病毒病的发病情况.结果表明,犬细小病毒病的发病与年龄、时间、季节、免疫状况等方面的因素有密切的关系,为临床实践提供了理论依据.     

实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点。近年来,实时荧光定量PCR技术在植物检疫研究上不断深入,大大提高了植物疫情的检测效率和监测防治水平。综合论述了实时荧光定量PCR技术在由真菌、细菌、病毒和线虫引发的植物疫情的检测与应用。     

免疫磁珠富集与SYB RGreen荧光定量PCR技术联合检测水体中甲肝病毒

本实验旨在建立一种免疫磁珠与SYBR Green荧光定量PCR技术联合检测水体中甲肝病毒的方法。通过制备特异性甲肝病毒免疫磁珠,优化病毒核酸提取方法,建立了免疫磁珠富集病毒和荧光定量PCR检测水体中甲肝病毒的方法。研究结果显示,1mg免疫磁珠与75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时,有最大抗体偶联量;该偶联后的磁珠富集甲肝病毒效率为92.87%。研究结果还显示,SYBR Green荧光定量PCR检测的标准曲线线性关系良好(R~2=0.999),检测极限低至9.27×10~1拷贝/μL。本研究结果表明,免疫磁珠与SYBR Green荧光定量PCR技术结合,具有特异性强、灵敏度高、可信度强、简便快捷的优点,本方法对水体中甲肝病毒污染状况检测与评价提供了有力的技术支持。     

犬瘟热病毒感染的诊断方法比较

采用犬瘟热病毒抗原快速检测试纸和RT-PCR方法,对2008～2009年在兰州市和乌鲁木齐市的50份疑似犬瘟热患病犬样品进行检测对比,结果发现这2种方法的符合率达96%。犬瘟热病毒抗原快速检测试纸是一种比较可靠的临床检测犬瘟热病毒感染的方法,而敏感性和特异性很高的RT-PCR方法更适合研究领域。     

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR的建立及4种检测试剂盒的比较

为评估目前常用商品化非洲猪瘟荧光定量PCR检测试剂盒,参考OIE推荐的非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光定量PCR方法合成引物和探针,建立非洲猪瘟病毒qPCR检测方法(OIE-qPCR);并与市面4种ASFV检测试剂盒进行了比较.以人工合成的ASFV p72基因TA克隆重组质粒为阳性标准品,OIE-qPCR可以检测到10～102 copies;而4种ASFV荧光定量PCR检测试剂盒中,进口试剂盒TF-qPCR能检测到10 copies,进口试剂盒ID-qPCR和国产试剂盒QD-qPCR能检测到10～102 copies,而国产试剂盒LY-qPCR能检测到102 copies.对健康猪组织样及临床模拟样品的检测结果显示:OIE-qPCR与4种检测试剂盒之间的符合率为92.60％～99.03％.其中,阳性样品CT值的相关系数为0.988～0.997(Perason法),表明各试剂盒之间相关性良好;但在检测病毒核酸含量较低的样品时,各试剂盒结果之间存在一定差异,其中,TF-qPCR试剂盒显示更高的阳性检出率,ID-qPCR试剂盒和LY-qPCR试剂盒次之.本研究为临床选用非洲猪瘟病毒快速检测试剂盒提供了依据.     

犬瘟热病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

[目的]建立一种犬瘟热病毒(CDV) RT-nested PCR检测方法.[方法]根据CDV弱毒株Onderstepoort 的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性、重复性实验.[结果]特异性试验表明,该方法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)以及正常Vero细胞中均未扩增出该条带.敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-3稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者.重复性实验表明,不同情况下的3次重复实验,结果相同.用RT-nested PCR对石河子地区疑似感染CDV的病料进行检测,结果表明,该研究建立的RT- nested PCR不仅能有效的检测CDV感染,而且能够检测不同组织的样品.[结论]建立的RT-nested PCR检测方法,适用于动物CDV的快速诊断和流行病学调查.     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪细小病毒VP2保守区基因194 bp片段,并克隆到pGEM T载体上,纯化质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪细小病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对10份疑似病料和阴性病料进行了检测,发现10份均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出7份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪细小病毒(PPV)的检测.     

检测犬源狂犬病毒中和抗体ELISA方法的建立

为了有效监测犬免疫狂犬病疫苗后的保护效力,以狂犬病毒(Rabies virus,RV)糖蛋白的主要优势抗原表位区G3蛋白(RV G3)作为包被抗原,建立了一种检测狂犬病毒中和抗体效价的间接ELISA方法.通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量为8 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶3 000.特异性试验表明,该抗原不与犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒阳性血清发生交叉反应;批内和批间重复性试验的平均变异系数都小于10%;敏感性达1∶1 280.此方法检测134份血清样品的结果与美国SYNBIOTICS试剂盒相比,总符合率达95.6%.     

新疆石河子市犬瘟热的流行病学与防治调查

采用流行病学、临床诊断学及犬瘟热病毒抗原快速诊断方法,对2009年新缰石河子市临床病例诊断及犬瘟热病毒抗原诊断的犬瘟热病例进行了调查,结果表明:发病犬以3～12月龄最多,纯种犬比杂种犬的发病率高,每年3-4月发病率最高,占全年发病犬的,未免疫或免疫1次的比免疫2次以上的发病率高。     

实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便、快速高效,高通量,而且高敏感性等特点,该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用。文章对实时荧光定量PCR的原理、影响因素以及在植物病害和遗传育种方面的应用等进行了综述。