对FC株猪源性肠毒素型大肠杆菌致病因子的研究

FC菌株是一株从腹泻仔猪粪便中分离的肠毒型大肠杆菌(Entcrotoxigenic E.coli,ETEC)。在MRHA反应中,本菌能凝集人O型、豚鼠、马、绵羊、牛、鸡和兔的红细胞,对人O型和豚鼠红细胞有很高的血凝性,血抗K_(88)和K_(99)血清不能抑制其对豚鼠和绵羊红细胞的血凝.在体外小肠上皮细胞吸附试验中,本菌对仔猪小肠上皮细胞有强烈的吸附作用;透射电镜和扫描电镜观察证实了FC株菌除表面具有一种纤毛样结构外,还能定居在仔猪小肠段。血清学试验结     

对FC株猪源性肠毒素型大肠杆菌致病因子的研究

FC菌株是一株从腹泻仔猪粪便中分离的肠毒素型大肠杆菌○在MRHA反应中,本菌能凝集人○型、豚鼠、马、绵羊、牛、鸡和兔的红细胞,对人○型和豚鼠红细胞有很高的血凝性,血抗K_(88)和K_(99)血清不能抑制其对豚鼠和绵羊红细胞的血     

一株不表达K88、K99、987P粘附因子牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定

从西藏地区腹泻死亡牦牛中分离出一株肠毒素型大肠杆菌，该菌在形态特征，培养特笥和生化特性方面与大肠杆菌基本一致，血清学试验表明，该菌原O抗原属O148，K88，K99，987P单因子血清均不能凝集本菌，在MSHA反应中，木菌能凝集绵羊、豚鼠、马、鸡的红细胞，而K88、K99、987P抗血清均不能抑制其对绵羊、豚鼠、马、鸡红细胞的凝集，用腔接种对小白鼠具有太原市 致病性，乳鼠胃内投服试验和兔回肠结所试验证明，该菌能产生热稳定肠毒素和热敏性肠毒素，总之，该功得一株不表达K88、K99、987P的、能产生ST和LT的肠毒素型大肠杆菌，     

用豚鼠红血球M.R.E.血凝反应筛选和鉴定仔猪黄痢大肠杆菌K_(88)~ 抗原的研究

从江苏、上海、北京的七个县十一个患有新生仔猪腹泻的猪场分离到的225个大肠杆菌株中,有127个菌株能在0℃下对豚鼠红血球呈现m.r.e.血凝反应。随猪场不同,它们分属于5个O抗原型,用它们的OK血清和新鲜菌液作交叉凝集反应,表明它们都含有一个共同的K抗原。从这些菌株得到的表面m.r.e.血凝素提取物,在琼脂扩散沉淀反应中均能与这些OK血清形成一条共同的沉淀线。在所试的36个标准O抗原菌株中,有三个呈m.r.e反应阳性,凝集反应和琼扩反应也证明它们与上述病原菌株具有一种共同的K抗原和m.r.e.血凝素抗原。其中44752株的自发突变株在失去m.r.e.血凝活性的同时,也不再能与其它菌的OK血清发生交叉凝集反应,表明这种m.r.e.血凝素就是那个共同的K抗原。一系列试验表明,这种m.r.e.血凝素在对培养温度的依赖性、等电点沉淀及水溶性,颗粒大小、血凝性和抗原性等理化和生物学特性方面均与Stirm和φrskov等确定的大肠杆菌表面K_(88)抗原相一致。在体外试验中,这些m.r.e.阳性菌株能吸着于2～3日龄仔猪小肠前段上皮细胞上,表明它们确系K_(88)~ 大肠杆菌。在仔猪结扎肠试验中,它们具有肠道病原性,引起肠扩张,证明它们确系仔猪黄痢的致病菌。从仔猪水肿病、仔猪白痢、羔羊大肠杆菌病及拉痢幼兔分离到的大肠菌株均呈m.r.e.反应阴性。由此表明,对豚鼠红血球的m.r.e.血凝反应在鉴定黄痢致病菌株方面是特异性的。本文证明了,在没有标准K_(88)单因子血清的条件下,用m.r.e.血凝反应从国内流行菌株中筛选和鉴定K_(88)~ 大肠菌株是可行的,并且这种方法简单易行,便于普及应用。用m.r.e血凝反应还可以从己知K_(88)~ 菌株中发现K_(88)抗原方面的变异性。对来自江苏、上海、北京七个县十一个猪场的菌株的研究表明,在我国,大多数猪场的仔猪黄痢都是由K_(88)~ 大肠杆菌引起的。在国内引起黄痢的K_(88)~ 菌株中,至少有4个O抗原类型,其中以O_(60)在江苏、上海一带最常见。O_(60)型乃是国外尚未报道的含K_(88)的O抗原类型。自从φrskov et. al.(1961)在对仔猪有肠病原性的大肠杆菌中发现K_(88)抗原以来,许多学者陆续证明,从不同国家和地区黄痢仔猪分离到的病原性大肠杆菌,虽然可能具有不同的O、K、H抗原结构,但它们中大多数部含有一个共同的表面K_(88)抗原。一系列研究表明,K_(88)抗原是一种仔猪小肠上皮细胞吸着素,它与细菌在小肠前段的定居力有关。根据这些研究,英国一家公司研制了一种实验性疫苗,它是用提取浓缩的K_(88)抗原加到不同大肠杆菌株的混合液中制成的,该苗给妊娠母猪皮下注射后,可通过初乳为仔猪提供被动免疫,显著降低新生仔猪腹泻(即我国的黄痢)的发病率和死亡率。在我国,对K_(88)~ 大肠杆菌在仔猪黄痢的发病中究竟起多大作用,尚没有详细研究。在没有标准K_(88)单因子血清的条件下,本文探索了应用对豚鼠红血球的m.r.e.血凝反应从国内黄痢流行菌株中筛选和鉴定K_(88)~ 大肠杆菌的可能性,并根据它对肠上皮细胞的吸着性、抗原性及K_(88)抗原的一些理化特性进行了鉴定。研究的目的在于寻找一种简单易行的试验方法,以弄清K_(88)~ 大肠杆菌在我国的流行情况,从而为进一步开展黄痢防治的研究创造了必要的条件。     

牛源大肠杆菌分离株菌体抗原及菌毛特性研究

对一株牛源大肠杆菌JS株的菌体抗原及菌毛特性进行了研究。大肠杆菌JS株在Minca培养基上37℃培养18～24h,能够同时良好地表达菌毛抗原K99和F41。采用保温法和裂解法进行了菌毛提纯,取得了较好的效果。应用玻片凝集试验﹑抗D-甘露糖微量血凝试验(MRHA)进行菌毛特异性和粘附性研究。结果表明,K99、F41两种菌毛抗原不存在交叉凝集反应,其血凝谱能凝集牛﹑鸡的红细胞。     

15株NDV地方株的分离鉴定与生物学特性

从1998~2002年河南省洛阳地区代表性新城疫发病禽群中分离鉴定了15株新城疫病毒(NDV),并对其生物学特性进行了研究。结果表明,15株NDV均呈现良好的血凝活性和特异的血凝抑制特性;对鸡胚的致病作用可被新城疫阳性血清所抑制;对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT),1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉内接种的致病指数(IVPI)的测定证实,LD-6-01和LR-2-00株是弱毒株,其余均为强毒株;弱毒株的血凝素热稳定性较好,属慢速血凝解脱型;强毒株的血凝素热稳定性差,属快速或中速血凝解脱型;所有毒株均可较好地凝集鸡和人(O型血)的红细胞,但对其他动物的红细胞凝集性差异较大。对HI抗体为6log2的12日龄雏鸡攻毒试验结果表明,15个分离株中2个弱毒株可得到100%保护;13个强毒株中,LG-1-99,LR-1-98,LD-4-01和LD-3-00得到了70%~90%的保护,而其他9个分离株(LD-1-98,LD-2-99,LD-5-01,LD-7-02,LR-3-02,LW-1-02,LG-2-00,LA-1-99和LE-1-01)基本上得不到保护(0~20%),但所有得不到保护的试验组鸡的发病死亡时间均明显向后推迟。     

抗大肠埃希氏菌K99粘着素单克隆抗体及其特性测定

利用淋巴细胞杂交瘤技术已获得10株能稳定分泌抗大肠埃希氏菌K99粘着素单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为EK409、EKA7—3、EKA7—5、EKC6、EKD4—12、EKD4—19、EKA2、EKDS—12、EKD3和EKB8。除EKD4—12单抗的亚类为IgG_3以及EKA_2为IgG_2a外,其余单抗均是IgG_1。上述前3株单抗均具有直接凝集(DA),免疫荧光(IF)和ELISA3种免疫学反应,而其余单抗都只有IF和ELISA两种反应特性。无DA反应性。在这3种反应中,反应强度和效价最高的是EK409和EKA7—3,二者小鼠腹水的DA滴度可达1:2048,IF和ELISA的效价均为10~(-6)。这两株单抗能与所试的各株K99+菌呈阳性反应,是型特异单抗。余下的8株单抗中,EKA7—5只对K12:K99+和含有O101抗原的K99+的两类菌株呈阳性反应,其余7株单抗仅对O抗原为101的K99+菌发生反应.所有的K99单抗对所试的K88+或987P+或F41+的大肠秆菌均以夏其他种肠道杆菌均无交叉反应。EK409和EKA7—3单抗还具有抑制MRHA反应的特性。     

仔猪大肠杆菌病防治方法的研究——ⅡK_(88ac)因子血清的制备及用两种方法鉴定E.col_1 K_(88)~+株的比较

为了解吉林省猪源E·coli致病性菌株K_(88)~+抗原株的分离率,作者用从国外引入的标准K_(88)~+抗原株自制了K_(88ac)因子血清,并用该因子血清和m·r·e血凝反应检测了由三个地区、十个猪场分离的81株病源性E·coli。两种检测方法的检出率均为7.4％(6株)。但用以上两种方法检测已知抗原式的5株E·coli时,m·r·e血凝反应的检出率为1/5;K_(88ac)因子血清凝集反应的检出率为3/5。用提取K∈LD型抗原的方法证明了该3株菌均有L抗原。这说明因子血清凝集反应较m·e·r血凝反应的敏感性高。     

鲍氏不动杆菌MF1株的粘附特性

取从患病鳜鱼体内分离到的鲍氏不动杆菌 Ｍ Ｆ１株和３株 Ａ Ｔ Ｃ Ｃ不动杆菌参考株做血凝试验（ Ｈ Ａ）,１３种不同动物的红细胞对４株不动杆菌的血凝特性分析结果表明,鲍氏不动杆菌（ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍ ａｎｎｉｉ） Ｍ Ｆ１株能凝集人 Ｏ 型血以及鸡、鼠、绵羊、鲢、黄鳝等５种动物的红细胞, 不凝集鳜、罗非鱼、鲫、团头舫、鲤、欧洲鳗、鳙的红细胞, 且该种血凝不能被甘露糖抑制; 其它３株 Ａ Ｔ Ｃ Ｃ参考菌株对１３种红细胞均不能发生凝集。４株不动杆菌的粘附实验表明, Ｍ Ｆ１株可以粘附 Ｈ Ｅｐ２细胞, 每细胞粘附菌在２０个以上, 菌体粘附于细胞四周; ３株 Ａ Ｔ Ｃ Ｃ不动杆菌参考株对 Ｈ Ｅｐ２细胞不具粘附特性。以上４株不动杆菌对 Ｅ Ｐ Ｃ细胞 （鲤鱼乳头状上皮瘤细胞系） 均无粘附性。     

NDV La Sota株与H_9N_2亚型AIV血凝谱的比较研究

为进一步研究NDV与AIV的生物学特性,为二者的鉴别诊断提供科学的依据,应用微量血凝(HA)试验比较观察NDV(La Sota)与AIV(H9N2)对鸡等17种动物红细胞的血凝谱。结果显示:NDV(La Sota)与AIV(H9N2)均可凝集鸡、鸭、鸽、鹌鹑、麻雀、喜鹊、赤颈鸫、三趾鹬、鹰鸮、长耳鸮、羊、小白鼠和人(O型)的红细胞,均不凝集兔的红细胞,但对牛、犬、猪红细胞的血凝特性有明显的差异。NDV(La Sota)可凝集这3种动物的红细胞且凝集效价均较高,而AIV(H9N2)对其则不具有凝集作用。表明NDV(La Sota)与AIV(H9N2)对不同动物红细胞血凝谱具有一定的差异性,特别是对不同哺乳动物红细胞的血凝性差异明显。     

鹅源副粘病毒SF02株的生物学特性研究

研究鹅源副粘病毒SF02株的生物学特性，结果表明：毒株的血凝素热稳定性指数为3min，血凝为快速解脱型；能凝集鸡、鸭、鼠、鸽、鹅、人(O型和A型)的红细胞，对绵羊和山羊的红细胞略凝，不凝集牛和猪的红细胞；病毒SF02株对胰蛋白酶、氯仿、乙醚、pH3．0敏感，二价镁离子对病毒有保护作用；0．0l％的甲醛溶液既能灭活病毒，又能保持较好的抗原活性；鸡胚平均致死时间(MDT)为54h，1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)为1．88；实验感染草鹅、白皇鸽、七彩山鸡、鹧鸪、番鸭等100％发病与死亡，对杂交黄鸡、鹌鹑也有50％以上的致死率，对绿头野鸭则无死亡；这些结果为全面了解病毒的特性提供了一些科学依据。     

抗大肠埃希氏菌987P粘着素单克隆抗体的产生及其特性测定

用饱和硫酸铵沉淀和葡聚糖凝胶柱层析法从987P~+大肠杆菌培养物中分离和提纯987P抗原。以此抗原免疫BALB/C小鼠,取其脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/O—Ag14融合,获得两株能分泌抗987P特异单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为EP-22和EP-G1。经多次克隆化后,他们在体外培养中能稳定分泌高效价的特异单克隆抗体,于液氮中冻存三多个月。复苏后其分泌抗体能力仍不变。EP—22和EP-G1的腹水单抗,免疫荧光滴度高达10~5-10~6,直接凝集滴度均为2—4×10~2。EP-22培养上清的单抗免疫荧光滴度可迭10~2-10~3,直接凝集滴度为16—32。在间接免疫荧光和琼扩试验中,这两株单抗对所试的987P~+标准菌株和野毒菌株均具有高度的特异性,对不含987P而含其它粘着素(K88或K99或F41)的菌株以及肠菌科之其他细菌都不发生交叉反应。他们对pH2-9.8及4-56℃有较强抵抗力。用EP-22株小鼠腹水单抗直接标记的单克隆荧光抗体效果好,特异性高。EP-22和EP-G1单抗的免疫球蛋白亚类均属IgG1。     

猪乙型脑炎病毒广西分离株FC792E基因主要抗原域的原核表达及抗原性鉴定

对广西猪JEV FC792株的E基因主要抗原域Ⅰ、Ⅱ基因(Ea基因)进行原核表达及抗原性鉴定,为猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)诊断抗原和基因工程疫苗的研制奠定基础.结果:成功构建广西猪JEV FC792株Ea基因的克隆重组质粒pMD18-T-Ea及表达重组质粒 pET32a-Ea,经SDS-PAGE及Western blot鉴定表明,JEV FC792株Ea蛋白在Roetta(DE3)菌中成功进行融合表达,表达出约58 KDa的融合蛋白;经抗原性鉴定表明,表达的融合蛋白Ea能与猪JEV阳性血清抗体发生特异性反应,融合蛋白Ea具有良好的JEV抗原性.     

猪源ETEC的黏附素基因克隆与原核表达

[目的]克服传统方法制备黏附素抗原的缺点。[方法]应用PCR对猪源性产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的黏附素F4、F5和F6的质粒中扩增出faeG、fanC和fasG基因片段,克隆测序并与pET 32a(+)构建重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli表达菌株BL21(DE3),并分析其免疫原性。[结果]重组表达载体经IPTG诱导获得高效表达。血凝抑制试验表明,鼠抗血清能抑制标准的ETEC强毒株凝集红细胞,抑制效价在1∶128以上。这说明克隆表达的猪源ETEC黏附素蛋白具有良好的免疫原性。[结论]该研究可为进一步开发抗体制剂奠定基础。     

抗新城疫病毒血凝素中和性单克隆抗体的研制和免疫生物学特性鉴定——新城疫病毒的单克隆抗独特型抗体疫苗研究之一

作者以新城疫病毒(NDV)的强毒株F_(48)E_8为免疫抗原。应用淋巴细胞杂交瘤技术。获得6株抗NDV血凝素的中和性单克隆抗体,分别命名为F_4、FE_8、F_(14)、F_(14),FD_(12)和F_(32)。这6株单抗对NDV都表现出高度的血凝抑制(HI)活性和中和能力。其中FE_8和F_4单抗的HI效价分别达1:2~(17)和1:2~(16),鸡胚内中和效价分别达10~(-5)和10~(4.8)。这些单抗的特异性强,仅与NDV发生反应,而与感染家禽的常见病毒如传染性腔上囊炎病毒(IBDV)、小鹅瘟病毒(GPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭瘟病毒(DPV)均无交叉反应。在鸡体保护试验中,1ml 1:160倍稀释的FE_8或F_4腹水单抗均能使所试小鸡抵抗NDV强毒的攻击。上述结果表明,FE_8和F_4单抗不仅能为NDV的单克隆抗独特型抗体研制提供一种理想的免疫原(单克隆独特型抗体,Ab_1)。而且可用于新城疫的紧急预防。     

用四种血清学方法测定猪源肠致病性大肠杆菌K88抗原的比较试验

猪源肠致病性大肠杆菌,一般具有两种主要致病因素:(1)产生耐热性与不耐热性肠毒素(ST和LT),对肠粘膜细胞造成毒害作用;(2)菌体表面具有一特殊抗原(K88抗原),使病菌粘着于小肠前段粘膜绒毛上,顽固地停留于肠道,持续放出毒素.K88抗原是一种蛋白质抗原,有免疫原性.因此,测定大肠杆菌的肠毒素和K88抗原,在仔猪大肠杆菌病的诊断和防制上均有重大意义.对耐热性与不耐热性肠毒素的测定,作者已于本年先后报道.本试验以反向间接血凝和含A蛋白葡萄球菌(简称SPA菌)协同凝集试验,传统的试管凝集和玻片凝集试验,共四种方法测定K88抗原,进行比较.     

鸡肾型传染性支气管炎病变毒株的分离和鉴定

从疑似肾型传染性支气管炎(IB)死鸡肾脏中分离到1株病毒,经鸡胚传代,到第3代,出现卷缩胚,第8代,卷缩胚达到50%。第3~8代的尿囊液经胰蛋白酶处理后对鸡红细胞可引发凝集。以琼脂凝胶沉淀试验检测,病料处理后的收获液、第3~8代鸡胚尿囊液与肾型IBV抗血清均可形成沉淀线,其沉淀线与肾型IBV阳性抗原和肾型IBV抗血清之间形成的沉淀线发生完全融合。该分离株在鸡胚病毒干扰试验中对新城疫病毒LaSota株的增殖有显著干扰作用。动物回归试验,试验鸡感染分离毒株,发病率达100%,死亡率达40%,死鸡的病理变化明显而典型。结果表明,该分离毒株是鸡肾型IBV。     

育成牛K99 F41兼型大肠杆菌的分离鉴定

从肠毒血症病死的4头育成牛空肠内分离到4株革兰氏阴性细菌,经生化试验、O抗原鉴定、纤毛抗原检查、ST肠毒素测定及动物感染试验证明,分离的4株细菌均为兼有K99和F41两种纤毛抗原的产ST肠毒素的O_(142)血清型致病性大肠埃希氏菌。     

间接红细胞凝集试验在化脓棒状杆菌所致绵羊“肺脓肿病”诊断中应用的初步探讨

我们用化脓棒状杆菌反复冻融裂解制备的无菌体细胞抗原致敏的鞣化甲醛化和戊二醛化红细胞(在试验过程中发现甲醛化红细胞非特异性反应较戊二醛化红细胞为大,故在第2次试验及以后的试验中均采用致敏的戊二醛化红细胞)与从于田羊场疫群(“肺脓肿病”)羊中采回的绵羊血清(—20℃冰箱内保存)99份,健康羊群羊血清20份,免疫兔(化脓棒状杆菌菌体类毒素联合苗免疫)血清5份作间接血凝试验2次。发现疫群血凝抗体滴度分别在1:160—1:2560和0—5120之间(1:2560和1:5120以上稀释度来作测定),绝大多数羊(81.5％和83.19)血清学滴度在1:1280以上。接种疫苗2次并攻强毒后存活的兔免疫血清滴度均在1:1280以上(高于此水平的滴度未予测定)。90％健康羊血清滴度在1:40以下。看来本试验有高度的敏感性。试验过程中发现许多血清样品不同稀释度之间的凝集程度缺乏明显的差别,可能与非特异性凝集现象存在有关。为了消除这些现象作了四种稀释剂(0.2％明胶盐水、0.2％阿拉伯胶盐水、1:2500牛血清白蛋白盐水、1％兔血清盐水)消除非特异性作用的比较试验,发现以明胶和阿拉伯胶盐水消除非特异性凝集作用的效果最好,牛血清白蛋盐水次之,兔血清盐水最差。稀释剂以随用随配为宜,未用完的稀释剂即使在-20℃冰箱中保存,效果仍大大降低。根据本试验初步成果,我们建议在用间接血凝试验作化脓棒状杆菌病正式检疫时,判定标准可暂定为:血清抗体滴度1:20者为阳性,1:40者为可疑,1:80以上者为阳性。参照国外报导,Shigidi(1979)指出间接血凝在绵羊棒状杆菌传染的血清学诊断方法中具有胜过其他试验(试管凝集,凝胶扩散,抗溶血抑制、补体结合等试验)的优点。因之,本试验对化脓棒杆菌所致的肺脓肿的诊断在目前仍不失之为一种较好的血清学诊断方法。     

鸡新城疫病毒(NDV)特异的单克隆抗体研制成功

我院畜牧兽医系家畜传染病组,在成功地研制出抗猪大肠埃希氏菌粘着素抗原K_(88)的单克隆抗体之后,又建立了对鸡新城疫病毒特异的单克隆抗体杂交瘤细胞2株,分别命名为NDV-Hy-23-12-1和NDV-Hy-33-19-1。现已完成了该两株单克隆抗体的理化特性和免疫生物学特性的测定。经多次克隆化后,这2株杂交瘤细胞在体外连续培养100天仍能稳定地分泌高效价特异抗体。经液氮冻存4个月