一种新的杆状病毒转移载体的构建

从家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中分别克隆出其P10基因。从BmNPV P10中亚克隆得到其5′端上游片段,经PCR定位突变使之ATG区突变成一个BglⅡ酶切位点。从AcMNPVP 10中亚克隆得到基因3′端下游片段,克隆入经突变的BmNPV P10基因启动子的下游,构建成一个新的转移表达载体pBmAcPV-1,由于BmNPV和AcMNPV P10基因及两端的同源性高达90％以上,该载体可以分别与野生型BmNPV和AcMN-PV DNA进行同源重组。     

家蚕核型多角体病毒ie-2基因dsRNA表达载体的构建

为了研究ie-2基因的dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果,根据NCBI公布的BmNPV(T3株)基因组序列,克隆了BmNPV极早期表达因子ie-2.将该基因用亚克隆的方法导入到L4440载体中构建L4440-ie-2,并成功转入大肠杆菌HT115(DE3).IPTG诱导可以成功表达相应的dsRNA.     

家蚕核多角体病素Lef-1和DA26基因的克隆及部分序列分析

lef-1和DA26基因分别位于egt基因的上游和下游,从pUAc-egt中分离出EcoRI-XbaI 1.1kb的egt基因片段,进行缺口平移标记,获得探针。与BmNPV DNA经Hind Ⅲ酶切、电泳、转移至NC膜的DNA进行Southern blot杂交,发现BmNPV DNA的Hind Ⅲ D片段呈阳性。从BmNPV基因组中分离出10.4kb的Hind Ⅲ D片段,用EcoRI酶切得到Hind Ⅲ-EcoRI2.2kb、EcoRⅠ1.4kb和EcoRⅠ-Hind Ⅲ 6.8kb3个片段,分别克隆于pUC19中,命名为pUHE2.2、pUE1.4和pUEH6.8。经双链测序并与AcNPV相关基因序列进行比较,发现lef-1基因被克隆于pUHE2.2中,DA26基因克隆于pUEH6.8中。从所测定的lef-1和DA26基因的启动子及5’端部分序列来看,它们在AcNPV和BmNPV之间有极高的同源性。     

家蚕核型多角体病毒orf90基因在Bac-to-Bac家蚕杆状病毒系统中快速表达

【目的】利用BmNPV的Bac-to-Bac系统快速表达目的基因orf90,为深入研究该基因打下基础。【方法】将目的基因BmNPV orf90 克隆到转移载体pFasBacHTb上,并将报告基因egfp插入到orf90的3'末端,形成重组转移载体pFasBacHTb-egfp-90。在将其转化到含穿梭载体bacmid的感受态细胞DH10Bac中,通过转座作用,经白斑筛选得到重组穿梭载体。纯化DNA,用脂质体介导转染家蚕BmN细胞,得到重组病毒bacmid-egfp-90。【结果】转染细胞72 h后在荧光显微镜下可以观察到强烈的绿色荧光。重组病毒穿刺接种家蚕蛹,5 d后观察到很强的荧光。结果表明构建的Bac-to-Bac系统能在家蚕细胞和蛹体中正确的快速表达外源基因。【结论】证明BmNPV的Bac-to-Bac是一个快速表达系统,适合在家蚕上广泛应用。     

茶尺蠖核型多角体病毒SalI 1.1 k片段的克隆及gp41部分序列分析

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)是尚未完成基因组测序的一种杆状病毒.为了解其基因组的信息,从病虫中分离纯化了茶尺蠖NPV,提取基因组DNA,构建了EoNPV DNA的SalI酶切片段文库,并对阳性克隆进行测序,获得了EoNPV gp41基因的部分序列.序列同源性分析结果表明,EoNPV与LdMNPV之间gp41基因的同源性较高,而与AcMNPV及BmNPV的同源性较低.     

新孢子虫NcGRA7基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为筛选能与新孢子虫NcGRA7蛋白相互作用的靶蛋白,构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7。应用PCR技术从新孢子虫基因组DNA中扩增出NcGRA7基因,将其克隆至pMD-19T(simple)中,经过酶切鉴定后再连接至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上。结果表明:试验成功获得了NcGRA7基因片段,测序结果中序列无碱基突变,与目标基因序列同源为100%。试验成功构建的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7,为使用酵母双杂交技术筛选与NcGRA7蛋白相互作用的蛋白奠定基础。     

能产生多角体的可线性化杆状病毒的构建

【目的】改进用于同源重组研究的制备杆状病毒DNA的方法。【方法】采用PCR方法从BmNPV中扩增出多角体基因,并在其两端引入Bsu36 I酶切位点。将此片段克隆入转移载体pBacPAK8中,与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞,获得重组病毒。该病毒能形成多角体,便于纯化,同时可以被 Bsu36 I酶切。该重组病毒的多角体纯化后被裂解,并提取病毒DNA。病毒DNA经Bsu36 I酶切后,与含gfp基因的转移质粒共转染家蚕BmN细胞,在荧光显微镜下观察重组病毒的转染效率。【结果】BmNPV多角体基因克隆入转移载体pBacPAK8中后,与线性化的AcPak6及BmPak6 DNA共转染sf细胞及BmN细胞,均能产生大量的多角体。获得的重组病毒DNA经酶切后,进一步与含gfp基因的转移质粒共转染的实验表明,这种改造后的重组病毒仍具有较高的转染重组率。【结论】本实验成功地对用于同源重组的杆状病毒DNA进行了改进,简化了病毒DNA的纯化方法,并且重组效率较高。     

猪传染性胃肠炎病毒 M 基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

筛选与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白相互作用的宿主蛋白,构建M蛋白的诱饵载体pGBKT7-M.首先利用PCR技术从重组表达载体pFastBacTM-M中扩增得到M基因,定向克隆至载体pMD19-T simple,验证正确后克隆至酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确插入后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-M及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGold感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性及诱饵蛋白在酵母细胞内的表达情况.结果表明:扩增得到M基因738bp,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-M,此诱饵载体对酵母细胞无细胞毒性和自激活活性.Western blot检测到5×104左右的蛋白条带,显示诱饵蛋白在酵母细胞内稳定表达.     

家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展

追踪研究蚕体内的抗家蚕核型多角体病毒（Bombyxmori nuclearpolyhedrosis virus,BmNPV）基因与蛋白,了解家蚕抗BmNPV的机制,对减轻甚至解除血液型脓病、促进桑蚕产业发展具有重要意义。文章就家蚕抗BmNPV基因和蛋白的研究进展进行综述,提出今后对家蚕抗BmNPV的研究策略应是运用多种技术同时从DNA、RNA、蛋白质水平上进行研究,鉴定家蚕抗BmNPV基因或蛋白及其与抗BmNPV的相关性;再采用RNA干涉、转基因技术对家蚕进行基因操作,改变其对BmNPV的抵抗能力,确认这些基因、蛋白的抗病毒功能。另外,使用免疫组化、免疫共沉淀,ELISA等技术探索基因一蛋白、蛋白一蛋白间的相互作用,找到基因或蛋白的上、下游作用因子,解释清楚家蚕抗BmNPV的详细机制,为最终解除家蚕脓病危害、促进蚕业发展提供参考资料。     

家蚕核型多角体病毒IE1的多克隆抗体制备及鉴定

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)ie1 基因是BmNPVDNA复制的必需基因,其编码的IE1蛋白能够反式转录 激活杆状病毒早期基因的表达.为了进一步研究IE1蛋白在家蚕核型多角体病毒感染宿主过程中具体的功能,研究 通过PCR扩增BmNPVie1 基因片段,亚克隆到原核表达载体pET32,获得重组质粒pET32-IE1,经测序正确后, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株.通过IPTG诱导融合蛋白原核表达后,初步纯化收集抗原,免疫新西兰大白 兔,制备IE1多克隆抗体.应用制备的免疫兔血清进行Western-blot分析,结果显示多克隆抗体能特异识别BmNPV 的IE1和IE0蛋白.免疫荧光结果同样显示IE1蛋白定位于宿主细胞核病毒复制中心.IE1抗体制备的成功为进 一步研究IE1在病毒感染家蚕中的作用机理奠定了基础.     

拟南芥At4g05060基因的酵母双杂交诱饵表达载体的构建、表达及自激活检测

为研究At4g05060基因功能,采用PCR扩增拟南芥VAMP(vesicle-associated membrane protein)家族基因At4g05060的ORF序列,定向克隆至酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7,经酶切鉴定并测序后将其转化至酵母Y187细胞;然后采用Western blotting技术分析At4g05060基因在酵母中的表达水平,通过缺陷型培养基培养进行自激活检测。结果表明,成功构建酵母诱饵表达载体pGBKT7-At4g05060,并在酵母细胞正确表达,表达产物对报告基因无自激活作用。     

同源重组快速构建甘蓝SCR 酵母双杂交诱饵载体及其自激活作用的检测

采用巢式PCR获得甘蓝SCR的成熟肽编码区,利用同源重组技术首次将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-SCR,结果表明:通过巢式PCR获得了正确的甘蓝SCR成熟肽编码区,并成功构建到pGBKT7诱饵载体中,且转化有诱饵载体的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,而在SD/-His-Trp和SD/-Trp/X-a-Gal/AbA营养缺陷平板上皆不能生长,说明对报告基因无自激活作用;且毒性实验也表明,SCR蛋白对酵母没有毒害作用.     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。     

柽柳类锌指基因ThZFL酵母诱饵表达载体的构建及其表达验证

利用PCR技术从柽柳cDNA文库中克隆出ThZFL目的基因序列,连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态,经检验后提取质粒,用BamH I和EcoR I限制性内切酶双酶切pMD18-T-ThZFL载体和pG-BKT7-BD空载体,并将酶切产物胶回收后,用T4 DNA连接酶连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态...     

Lescpth5诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

[目的]构建诱饵载体pGBKT7-Lescpth5,并检测其转录自激活活性及对酵母细胞的毒性。[方法]采用PCR技术扩增Lescpth5基因,连接到诱饵载体pGBKT7上,转化重组载体于酵母感受态细胞AH109中,在营养缺陷型培养基上进行自激活检测和毒性检测。[结果]酶切和测序鉴定结果显示诱饵载体pGBKT7-Lescpth5构建成功,读码框正确。自激活检测结果和毒性检测结果显示诱饵载体对酵母菌株AH109没有转录激活活性,对酵母菌也无毒害作用。[结论]成功构建的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步的cD-NA文库筛选奠定基础。     

酵母双杂交技术筛选与绵羊微管解聚蛋白相互作用的蛋白

采用TRIzol法提取绵羊卵巢组织总RNA,运用RT–PCR技术扩增绵羊微管解聚蛋白基因(STMN1)的编码区序列;通过同源重组技术构建重组诱饵表达载体pGBKT7–STMN1,鉴定该诱饵蛋白在酵母双杂交系统中的自激活活性、细胞毒性和表达情况;利用诱饵质粒pGBKT7–STMN1从绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交cDNA文...     

新城疫病毒V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

为构建新城疫病毒(NDV)V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒,用RNA试剂盒提取NDV F48E9株的RNA,通过反转录试剂盒将抽提的RNA反转录,以反转录合成的eDNA为模板,通过PCR扩增,获得V蛋白C端基因(VCTD).通过酶切连接的方法将V蛋白C端基因克隆至pGBKT7载体上,命名为pGBKT7-VCTD.将pGBKT7-VCTD转化酵母Y2H Gold酵母感受态细胞,转化产物涂布营养缺陷型平板,观察平板上菌落生长情况,判定诱饵质粒有无自激活能力:同时挑取平板上的生长的菌落接种液体培养基培养,绘制生长曲线,判定pGBKT7-VCTD诱饵质粒有无毒性.酶切和测序结果表明,成功构建pGBKT7-VCTD诱饵质粒,且该诱饵质粒在酵母细胞中无毒性和自激活能力.本研究成功构建了pGBKT7-VCTD诱饵质粒,为筛选NDVV蛋白C端纳米抗体奠定基础.     

拟南芥AtGRP7基因诱饵载体的构建及酵母双杂的初筛

AtCRPI基因是拟南芥的一个从动振荡器基因,目前其生理功能知之甚少。为了更好地研究与AtCRP7基因的互作蛋白,笔者利用PCR技术从携带AtGRP7基因序列的质粒中扩增该基因的编码序列,然后将目标序列插入pGBKT7载体的NcoⅠ和PstⅠ2个酶切位点之间,构成酵母双杂体系的诱饵载体。酶切和测序结果表明,构建的载体目标基因序列和阅读框是正确的。之后,将该载体转入感受态酵母Y2HGold菌株中,并检测其表达物对报告基因的激活情况。AtGRP7酵母转化菌在SD／-Tip平板上长势良好;在SD／-Trp-Ade平板上长势较弱;在SD／-Trp／-His和SD／-Trp／-Ade／-His平板上则没有生长。这说明His合成相关基因没有被转录和翻译,AtGRP7基因在该酵母双杂体系中没有自转录激活。笔者在酵母双杂的初步筛选中,还获得几个可能与AtGRP7互作的基因。     

葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2互作蛋白筛选与鉴定

【目的】从葡萄中克隆细胞分裂素响应调节因子VvRR2,获得VvRR2的互作蛋白,为阐明VvRR2在欧洲葡萄抗病反应中的作用机制提供依据。【方法】对葡萄接种白粉病菌,提取总RNA后反转录,利用实时荧光定量PCR检测VvRR2转录本对白粉病菌的响应;构建瞬时表达载体pBI221-VvRR2-GFP,转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析;构建酵母表达载体pGBKT7-VvRR2,转化酵母菌株AH109,检测VvRR2的转录激活活性;构建酵母表达cDNA文库,以VvRR2为诱饵,通过Mating法筛选互作蛋白,对获得候选序列进行Blast分析;将候选蛋白VvTGA的全长序列克隆至pGADT7载体形成重组载体pGADT7-VvTGA,与重组诱饵载体pGBKT7-VvRR2共转化酵母,进行双杂交验证VvRR2与VvTGA的相互作用;将VvTGA的全长序列克隆至pSPYNE（R）173载体,形成重组载体pSPYNE-VvTGA,将VvRR2的全长序列克隆至pSPYCE（M）载体,形成重组载体pSPYCE-VvRR2,然后将两个重组载体共转化拟南芥原生质体,利用双分子荧光互补技术验证VvRR2与VvTGA的相互作用。【结果】葡萄接种白粉病菌后,细胞分裂素响应调节因子VvRR2呈现受白粉病菌诱导表达模式。VvRR2定位在拟南芥原生质体的细胞核,转录激活试验结果表明VvRR2在酵母体内具有转录激活活性。在含有60 mmol·L^-1的3-AT培养基上可以抑制VvRR2诱饵载体的自激活活性,VvRR2诱饵载体对宿主酵母菌没有毒性。以VvRR2为诱饵,初步筛选到287个单克隆,在高严谨条件下进一步筛选获得23个有效序列,Blast分析显示这些基因参与蛋白质合成与降解、细胞分裂素信号传导、光反应和生物钟节律、生长发育和逆境响应。酵母回复双杂交试验结果显示含有空载体（pGADT7或pGBKT7）酵母在四缺培养基（含3-AT）上不能生长,含有两种重组质粒的酵母在四缺培养基（含3-AT）上能够生长,并在含有X-α-Gal的四缺培养基上能够显色。双分子荧光互补试验结果显示共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE（R）173、pSPYNE-VvTGA与pSPYCE（M）的原生质体没有黄色荧光,而共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE-VvTGA的原生质体显示黄色荧光。VvTGA的表达类似于VvRR2,呈现受白粉病菌诱导表达模式。【结论】葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2是一个受白粉病菌诱导表达的转录因子,能够与VvTGA相互作用,并且VvTGA受白粉病菌诱导表达。     

赤霞珠白藜芦醇合酶基因的克隆及酿酒酵母表达载体的构建

为克隆酿酒葡萄品种赤霞珠的白藜芦醇合酶基因并构建其酿酒酵母表达载体,利用改良CTAB法提取赤霞珠葡萄叶片组织中的DNA,根据文献报道的序列(Genbank登录号AF128861)设计引物扩增得到白藜芦醇合酶基因全长序列。将全长序列克隆至克隆载体后,通过重叠延伸PCR扩增到RS基因cDNA片段。然后分别将RS基因全序列和cDNA片段连接至真核表达载体pGBKT7,经克隆和测序分析后,构建两种真核表达载体pGBKT7/RSDNA和pGBKT7/RScDNA,用SD-trp选择培养基筛选出阳性克隆,菌落PCR验证得到阳性转化子。