小麦基因组文库的构建及高分子量(HMW)谷蛋白亚基基因的筛选

以小麦 NE7060的黄化苗为材料提取总 DNA,用 Sau3A 制备14～22kb 的酶切片段,以λEMBL3为载体构建了5.5×10~6个重组子的基因文库。根据已知的小麦 HMW 谷蛋白亚基基因5′端、中部重复区和3′端序列合成了三个寡核苷酸为探针,经原位杂交和斑点杂交筛选到10个阳性克隆,并对其中两个阳性克隆用 BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和 Sal Ⅰ进行酶切,初步确定了插入片段长度约20.0kb,建立了插入片段的物理图谱。     

家蚕核型多角体病毒egt基因的克隆和序列分析

从pUAc-egt中分离出EcoR I-Xba I 1.1kb的egt基因片段作为探针,克隆了家蚕核型多角体病毒镇江株的egt基因,对该基因作了酶切分析和基因定位,测定了该基因的全序列。并与AcNPV-C6株及BmNPV-T3株的egt基因作了比较,发现它们之间的同源性在95%以上,基因大小都为1518bp。     

减蛋综合征病毒基因组不同酶切图谱的比较研究

分别应用限制性内切酶HindⅢ、Xba Ⅰ、Soc Ⅰ、Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ对EDSV—gDNA进行单酶切以及以Hind Ⅲ为参照，选用适当内切酶进行双酶切，经对酶切图谱比较分析，以确定基因组中各酶切位点数及在Hind Ⅲ片段上的位置。结果表明：HindⅢ、Xba Ⅰ、Soc Ⅰ、Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切片段分别为9、2、2、5、4、4条，Hind Ⅲ Xba Ⅰ、Hind Ⅲ Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ Sac Ⅰ、Hind Ⅲ BamH Ⅰ及Hind Ⅲ XEcoR Ⅰ分别为10、10、11、11和13条，为进一步研究禽类腺病毒的分子生物学特性和构建腺病毒表达载体奠定了良好的基础。     

限制性内切酶分析鸭瘟病毒DNA

本文报导了一种限制性内切酶图谱分析法鉴别鸭瘟强毒株及疫苗株的微量快速方法。该法选用HindⅢ、HinfⅠ、BamHⅠ、PostⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ七种限制性内切酶,酶切两毒株图谱表明酶切分子量范围1.43-22×10~6道尔顿,HindⅠ羌酶切位点,EcoRⅠ两毒株图谱相同;HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ、SalⅠ、XhoⅠ这五种酶切后的片段数、片段大小、迁移率可准确鉴别两毒株。直接裂解感染细胞是种快速、简便的抽提鸭瘟病毒DNA的方法。     

鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建

用碱裂解法对鹅细小病毒延边分离株进行GPV基因组DNA提取.根据已发表的鹅细小病毒VP3基因序列,设计1对含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,以GPV基因组DNA为模板,应用PCR扩增出VP3基因片段,将VP3基因与克隆载体pMD 18-T连接,转化到感受态大肠杆菌BL21中进行克隆.用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAXI真核表达载体中,获得重组质粒pVAXI-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性.     

捕获输出蛋白编码基因的小分子量质粒载体的构建与验证

自行设计一对引物,从质粒pUC18上扩增一段无启动子和信号肽的β-内酰胺酶基因(△P△SP Amp),经pGEM-T-EASY载体克隆到pET-28衍生质粒pKan的EcoRⅠ和XbaⅠ间,得到在Kan平板中生长而在Amp和Kan双抗平板中不能生长的转化子pMBL-E质粒.经部分酶切补平自连,筛选得到消除HindⅢ位点端EcoRⅠ位点的质粒,即为用于输出信号基因片段捕获的目的载体pMBL,大小为 3.46 kb.经酶切鉴定和测序分析,表明构建的载体与预期设计的一致,并应用四环素抗性基因(Tetr)对载体的有效性进行了验证,证明构建的载体pMBL能有效捕获含启动子和信号肽序列的输出蛋白编码基因.     

黄鳝线粒体DNA的提取及其酶切分析

用碱裂解法从黄鳝肝脏组织中提取线粒体DNA,并对提取的线粒体DNA纯度、完整性进行了检测.结果表明,其紫外吸收比值为OD26/280在1.72～1.96之间,纯度较高,琼脂糖凝胶电泳表明提取线粒体的完整性好;用EcoR Ⅰ和HindⅢ对黄鳝线粒体DNA进行酶切,用琼脂糖凝胶电泳检测,均能检测出两套不同的酶切片段,证明黄鳝线粒体DNA存在多态性.     

生长抑素基因初级克隆质粒（pUC12—SS）的改造与鉴定

生长抑素(somatostatin,ss)基因初级克隆质粒(pUC12-SS)含有限制性内切酶BamHI和HindⅢ的重复位点,用HindⅢ酶切处理和T_4DNA连接酶连接后。获得了它们的单一位点。并对经过修饰后的质粒进行了多个酶位点、SS基因片段回切和DNA序列等全面分析和证实。     

山羊痘病毒P32基因重组真核表达载体的构建与鉴定

根据已发表的山羊痘病毒P32基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用PCR方法从分离的贵州山羊痘病毒LD毒株中扩增出含P32基因的DNA片段,纯化后,经BamHⅠ/HindⅢ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),获得pcDNA3.1(+)-P32/LD重组载体。通过PCR、双酶切及测序鉴定,证实重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-P32/LD构建成功。     

鉴别丁香假单胞菌丁香致病变种和豌豆致病变种的 DNA 探针的制备

把引起豌豆枯萎病的丁香假单胞菌丁香致病变种 Pseudomonas syringae pv.syringae 菌株3319和丁香假单胞菌豌豆致病变种 P.syringae pv.pisi 的模式菌株2452的染色体 DNA 分别用限制性核酸内切酶 HindⅢ完全消化,再用 T_4DNA 连接酶把消化好的 DNA 片段连接到用HindⅢ内切酶消化的质粒载体 pUC19上,然后把重组的质粒载体转化到大肠杆菌(E.coli RR1)中去克隆.把菌株3319和2452的 DNA 用 p~(32)标记做成探针,分别与克隆菌落杂交,筛选出只对菌株3319的 DNA 有特异性的1个重组 DNA 的克隆和对菌株2452的 DNA 有特异性的2个重组 DNA 克隆.再把这3个重组质粒 DNA 分别用 P~(32)标记做成探针,与菌株3319和2452的 DNA 杂交,也显示只对各自 DNA 来源的菌株具有特异性.这3个重组质粒中,有2个携带有菌株2452的 DNA 片段,1个为0.82 kb。另1个略小于0.58 kb,还有1个质粒携带有菌株3319的 DNA 片段,为0.85 kb.     

番茄灰霉病病株根际土壤宏基因组文库的构建

利用宏基因组DNA提取试剂盒提取番茄灰霉病病株根际土壤微生物宏基因组DNA,经PstⅠ和HindⅢ双酶切,回收1-5kb大小的片段,与经过相同酶酶切的PblueScriptⅡKS（＋）质粒载体相连接,转入大肠杆菌DH5a,构建了番茄灰霉病病株根际土壤微生物宏基因组文库。     

黑龙江镜鲤基因组DNA文库的构建

纯化镜鲤体组织的高分子量基因组DNA,经限制性内切酶Sau3A Ⅰ部分消化后,10％-40％蔗糖密度梯度离心分离并回收9—23kb的DNA片段。以λDASHⅡ为克隆载体,与9—23kb的DNA片段进行连接和包装,构建了镜鲤的基因组DNA文库。随机选取5个独立的噬菌斑,提取DNA后用EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ进行酶切分析,证明克隆插入率为100％。经测定,该文库的滴度是108pfu/mL,根据公式N=ln(1-P)/In(1-f),99％的镜鲤基因组包含在该基因组文库中。以鲤IGF-Ⅱ基因探针对该基因组文库进行Southem杂交,筛选到相关的阳性克隆,证明这是一个较为完整的镜鲤基因组DNA文库。     

鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建和鉴定

构建鸡胚成纤维细胞(CEF)T7噬菌体表达型cDNA文库,为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定基础。提取纯化CEF的mRNA,反转录合成双链cDNA,补平末端,连接EcoRⅠ/HindⅢ接头,双酶切,凝胶过滤层析除去小于400bp的cDNA片段,合成双链cDNA定向与T7噬菌体左右臂连接,体外包装后建成cDNA表达文库。测定文库大小、重组率,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果表明,构建的cDNA文库滴度为2.2×107pfu/mL、扩增后滴度为3.5×1010pfu/mL,重组效率达98%、插入片段多在0.4～3kb之间,平均插入片段长约1.3kb。表明所建文库具有很高的质量,从而为筛选目的cDNA克隆奠定了基础。     

Epstein-Barr病毒胸苷激酶（TK）基因表达质粒的构建

目的：构建高效表达EBVTK的重组克隆体系。方法：以pUC8X为模板，5'-CTGAATTCATG—GCTGGATTTCC-3’及5’CAACTGCAGCCTAGTCCCGATT-3’为引物，用PCR技术扩增出EBVtk基因的DNA片段。EcoR I／Pst I双酶切PCR产物和载体pBV220，T4连接酶使目的基因tk定向克隆至选定质粒pBV220中。结果：重组质粒pBV220-tk经EcoR I／Pst I双酶切后得两条电泳带分别位于1．8kb、3．6kb处；以pBV220-tk为模板，两引物同上进行PCR扩增，产物电泳带于1．8kb处。结论：目的基因tk已定向克隆至质粒pBV220中。     

黑龙江镜鲤基因组DNA文库的构建

纯化镜鲤体组织的高分子量基因组DNA,经限制性内切酶Sau3A Ⅰ部分消化后,10％-40％蔗糖密度梯度离心分离并回收9—23kb的DNA片段。以λDASHⅡ为克隆载体,与9—23kb的DNA片段进行连接和包装,构建了镜鲤的基因组DNA文库。随机选取5个独立的噬菌斑,提取DNA后用EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ进行酶切分析,证明克隆插入率为100％。经测定,该文库的滴度是108pfu/mL,根据公式N=ln(1-P)/In(1-f),99％的镜鲤基因组包含在该基因组文库中。以鲤IGF-Ⅱ基因探针对该基因组文库进行Southem杂交,筛选到相关的阳性克隆,证明这是一个较为完整的镜鲤基因组DNA文库。     

淋球菌4.2kb质粒DNA的克隆

用碱变性法从淋球菌D参考菌珠获得4.2kb质粒DNA,用Hind Ⅲ限制性内切酶消化4,2kb质粒DNA和pBR322载体质粒DNA,经T4连接酶连接后,转化到E.coli MC1061菌株中,获得氨苄抗性转化子。经     

奶牛瘤胃微生物BAC文库中脲酶克隆的筛选与分析

利用脲酶选择性培养基,从奶牛瘤胃微生物BAC文库的15 360个克隆中筛选得到了12个脲酶克隆.利用酚-次氯酸法对脲酶克隆子的酶学性质分析,表明均具有不同的尿素分解能力,酶的活力范围是30～2 466 U/mg.脲酶阳性克隆插入片段大约是60 kb,限制性内切酶Hind Ⅲ酶切图谱表明,各个克隆具有不同DNA片段,其中脲酶Urease 1、Urease 3、Urease 4和Urease 9的最适pH8.0,最适温度为60℃.本研究从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选到了具有脲酶酶活特性的克隆.     

云南龙陵黄山羊线粒体DNA限制性酶切分析

 采用碱性变性法提取来自于龙陵县不同地区的18只黄山羊个体的线粒体DNA(mtDNA),并用ApaⅠ,AvaⅠ,BamHⅠ,BclⅠ,BglⅠ,BglⅡ,ClaⅠ,DraⅠ,EcoRⅠ,EcoRⅤ,HaeⅠ,HindⅢ,KpnⅠ,PstⅠ,PvuⅡ,SacⅠ,SalⅠ,SmaⅠ,StuⅠ和XhoⅠ等20种限制性内切酶进行酶切分析.结果发现龙陵黄山羊线粒体DNA的分子量大小约为15.8Kb;不同酶的酶切位点分别为:DraⅠ有7个酶切位点,AvaⅡ有6个酶切位点,EcoRⅤ和StuⅠ共有5个酶切位点,HindⅢ和HeaⅡ有4个酶切位点,BamHⅠ,BglⅡ,PstⅠ和PvuⅡ有3个酶切位点,ApaⅠ,ClaⅠ有2个酶切位点,其余有1个酶切位点.     

柞蚕核多角体病毒基因工程载体的研究 Ⅰ柞蚕核多角体病毒DNA限制性内切酶图谱

本文研究了柞蚕核多角体病毒的分离、纯化、纯化后的病毒DNA经限制性内切酶Pat Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、XhoⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ及EcoRⅠ+BamHⅠ等酶解后电泳分别形成31、26、6、15、24、5及7条区带。据内切酶图谱测算柞蚕核多角体病毒的分子量为75.16±2.3×10~6道尔顿。并比较了柞蚕、蓖麻蚕及家蚕等核多角体病毒的亲缘关系。