丁香假单胞菌中六个致病变种的全细胞蛋白质电泳分析

 利用聚丙稀酰胺电泳技术首次对丁香假单胞菌中6个致病变种全细胞蛋白电泳,发现同一致病变种内菌株蛋白条带一致,不同致病变种之间存在差异.以往对丁香假单胞菌中致病变种的鉴定方法主要是根据致病性的差异,结合营养筛选和血清学方法来进行.对丁香假单胞菌的6个致病变种的全细胞蛋白分析表明:全细胞蛋白质电泳能成功地鉴定到致病变种.     

丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆表达与功能研究

采用PCR方法从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株中分别克隆到大小为1 026和1 038 bp的hrpZ基因(hrpZPsgA1和hrpZPsgS1),对该基因进行了原核表达和功能研究。SDS-PAGE显示其表达产物为相对分子质量62×103的融合蛋白,harpinZPsgA1和harpinZPsgS1的相对分子质量约为35×103。harpinZPsgS1的粗提蛋白经GSTrap FF纯化后质量浓度可达1.1 mg.mL-1。生物活性检测表明,该蛋白对热稳定,对蛋白酶K敏感,可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应,过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制,并且对烟草有明显的促生作用。序列比对发现,来自丁香假单胞大豆致病变种的hrpZ基因可分为2类,一类以hrpZPsgA1为代表,包括hrpZPsg12,另一类以hrpZPsgS1为代表,包括来自r0和Race4菌株的hrpZ基因。这2类hrpZ基因的核苷酸同源性为79%,氨基酸同源性为77%,均富含甘氨酸,不含半胱氨酸,与假单胞菌属以外的其他革兰氏阴性植物病原细菌harpin编码基因不存在相似性。     

奉新县猕猴桃溃疡病病原菌鉴定

为明确江西省奉新县猕猴桃溃疡病病原菌种类。从该县7个猕猴桃生产基地采集呈典型症状的发病枝条和叶片,采用稀释分离法对其进行病菌分离并作致病性测定,共获得27个致病性细菌菌株。对各菌株进行培养性状、形态特征观察和生理生化测定,结果与文献中对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)的描述相吻合。提取各菌株基因组DNA,分别对其16S rDNA和16S-23S rDNA基因片段进行PCR扩增、测序、序列分析和构建系统发育树,结果各菌株16S rDNA和16S-23S rDNA序列长度均为1 500 bp和280 bp,且菌株间序列完全一致。将获得的两段序列利用Blast程序分别在GenBank中进行同源性搜索,发现其与丁香假单胞菌猕猴桃致病变种同源性均为100%。待鉴定菌株在系统发育树上与该变种处于同一分支。根据实验结果,将奉新县猕猴桃溃疡病的病原鉴定为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。     

嗜麦芽单胞菌AT18的染色体DNA高活性启动子的克隆

将从嗜麦芽单胞菌AT18的染色体DNA获得一段约1.4kb的DNA片段克隆进启动子探针载体pKK232-8,转化大肠杆菌HB101获得重组质粒PAS1(具有很强启动活性),可抗Cm达1 000 μg/mL.实验采用亚克隆技术,经过提取质粒、酶切、电泳、回收、连接等步骤将该有启动活性的插入片段缩小,欲获得一段有强的启动功能的最小活性片段.首先通过单酶切图谱发现该插入片段上有3个单酶切位点即kpnI、BglⅡ和PstI;再将双酶切所得各DNA片段设计为不同的方案,或直接连接,或末端补平连接,或亚克隆处理,以启动子探针质粒pKK232-8为载体,转化大肠杆菌HB101,利用氯霉素平板筛选重组质粒.结果表明,该插入片段的活性功能存在于Kpn1和HindⅢ双酶切所得的一段约300 bp的DNA片段,将该小片段进行亚克隆所得重组质粒PAS1-3仍有很强的Cm抗性.     

水稻基因组文库的构建及YR-DNA的筛选

为了克隆决定染色体形成的特异DNA片段YR-DNA,以λExCell为载体,克隆经限制性内切酶EcoRI消化后的水稻基因组DNA,λ噬菌体体外包装构建了滴度为1.2×106 pfu/ml,重组效率达86%的小型水稻基因组文库.随机选取了50个重组克隆,质粒释放后进行酶切鉴定,插入序列的大小为0.5～7 kb,平均为3 kb.以水稻基因组DNA为探针对基因组DNA文库进行筛选,从10 000个重组子中选出200个杂交信号较强的阳性克隆,质粒释放后点渍杂交进行第2轮筛选,从中选取40个杂交信号较强的重组子,再次进行斑点杂交,选取10个杂交信号最强的重组子.酶切并回收基因组插入片段,标记特异的重组片段,与不同酶切后的水稻基因组DNA进行Southern杂交,其中有两个探针杂交后基因组酶切带上杂交信号呈弥散状,表明重组片段为散在重复序列.     

丁香假单胞菌极毛蛋白hrpA基因的克隆与表达

将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.     

淋球菌4.2kb质粒DNA的克隆

用碱变性法从淋球菌D参考菌珠获得4.2kb质粒DNA,用Hind Ⅲ限制性内切酶消化4,2kb质粒DNA和pBR322载体质粒DNA,经T4连接酶连接后,转化到E.coli MC1061菌株中,获得氨苄抗性转化子。经     

丁香假单胞大豆致病变种不同HrpZ蛋白差异区域功能研究

[目的]丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株编码产生的Hrp Z蛋白差异序列主要集中在C端的3个区域,并且这2个蛋白诱导非寄主HR的能力也存在差异。本研究将探究Hrp Z蛋白这3个差异区域在烟草上诱导HR(hypersensitive response)和抑制烟草花叶病毒(TMV)中所起的作用。[方法]采用常规PCR及重叠PCR方法将这2个hrp Z基因的3个差异区域分别进行互换,构建了相应的重组表达载体,表达并纯化得到了6个重组蛋白,相对分子质量均在41×103左右。并检测了其诱导HR活性、诱导植物抗病性。[结果]检测结果表明:重组蛋白Hrp ZS(S2→A2)和Hrp ZA(A3→S3)诱导HR的能力相比亲本都有所增强,6个重组蛋白诱导烟草抗TMV的活性都明显强于亲本,其中,Hrp ZA(A3→S3)和Hrp ZS(S3→A3)的活性最强。[结论]此试验表明Hrp Z蛋白的这些差异区域(第7、8、9个α-螺旋)是过敏反应能力的主要调控区域,同时C-端第8、9个α-螺旋区域与诱导植物抗病性也显著相关。本研究为改造Hrp Z类harpin蛋白激发子,提高其诱导抗性及功能域研究提供了理论依据。     

猕猴桃溃疡病病原菌的分子鉴定和致病力测定

为明确猕猴桃细菌性溃疡病致病菌种类与特征,以从安徽岳西、陕西户县和重庆黔江等猕猴桃主产区收集到的溃疡病感染枝条和树皮为材料,采用平板划线、梯度稀释和BPA培养法分离病原物,采用烟草过敏性反应和猕猴桃健康叶片接种观察其致病性,结合特异引物扩增的16S-23SrDNA-ITS序列分析,对病原菌种类进行分子鉴定。结果表明:从收集的溃疡病感染枝条和树皮中,共分离纯化得到10株分离物;所有分离物均可使烟草叶片产生过敏反应,猕猴桃叶片接种显示同一菌株对不同品种及不同菌株对同一品种的致病力均存在差异。对特异扩增得到的280bp 16S-23SrDNA-ITS序列进行Blast比对分析,结果表明:10个菌株为同一致病菌,其DNA片段大小和序列均与丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidae)完全一致。据此可以确定,试验分离所得的菌株均为丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种。     

链霉菌高拷贝质粒pIJ101DNA的研究 I．在大肠杆菌中的启动子活性

用大肠杆菌座子与Tn5个去除了自身启动子区域的卡那霉素抗性基因（neo)作为指标标记来探测广寄主、高拷贝的链霉菌质粒pIJ101上DNA的启动子活性所做的基因融合试验揭示，pIJ101上至少有两个可大大肠杆菌中行使启动子功能的DNA片段。基因融合后所产生的杂合质粒能够赋予大肠杆菌ED8767较高的卡那霉素抗性。对含质粒菌株在液体培养基中的生长动力学分析揭示，这种菌株在从无药物向有药物的生物环境中过渡时，生长并不受到暂时的抑制。说明这种启动子活性不是pIJ101DNA上DNA的突变所引起。用大肠杆菌的启动子探针载体pKK232-8所做的体外亚克隆试验更进一步证实了这项观察，并把两个启动子功能区分别缩小到0．54kb和1．18kb的范围内。这项试验成功地组建了质粒pIJ101亚克隆库，便于对这个重要的链霉菌质粒进行精细的分子生物学研究。     

Pear Blossom Blast Caused by Pseudomonas syringae pv.syringae in China

This study was done to determine the causal organism of the pear blossom and bud blast in China. It was identified by a bacteriological test, electro-microscopic observation, Koch＇s postulate test, Biolog, fatty acid methyl esters （FAMEs）, and a polymerase chain reaction （PCR） test, and compared with the standard reference strains. Six representative strains out of 20 pathogenic bacterial isolates from 16 diseased samples showed characteristics similar to three standard strains of Pseudomonas syringae pv. syringae from Belgium. They were identified as P. syringae pv. syringae with a Biolog similarity of 0.57-0.86 and FAMEs similarity of 0.58-0.81. The bacterium was reisolated from the symptomatic plants and blossoms. Identification as P. syringae pv. syringae was confirmed by using PCR primers and sequence tests, and compared with the above-mentioned results. The data supported the fact that the pear blossom and bud blast in China could be caused by P. syringae pv. syringae.     

云南烟草野火病菌菌系分化研究*

 研究采用24个采自云南省各大烟区的烟草野火病菌对24个普通烟草品种及2种野生品种长花烟和黄花烟进行致病性接种试验。根据这26个烟草品种对烟草野火病菌株的抗性反应，将接种后形成病斑的直径进行聚类分析，筛选了一套烟草野火病生理小种的鉴别寄主。并以此为依据将24个病原菌株划分为两个生理小种，即0号和1 号,为抗病育种工作提供了依据。     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

大豆细菌性斑点病菌hrpZPsg12基因增强病原菌对大豆的致病性并引起烟草过敏性反应

[目的]明确hrpZPsg12基因对大豆细菌性斑点病菌致病性的影响。[方法]采用PCR方法从大豆细菌性斑点病菌中克隆hrpZPsg12基因,利用具有自杀特性的敲除质粒pKNOCK-Cm和具有功能互补作用的粘粒pUFR034,构建了hrpZPsg12基因的突变载体pKNOCK477-7和互补载体pUFR1026-68,并筛选出hrpZPsg12基因的突变体477-1及其功能互补子1026-5。进一步将野生型Psg12、突变体477-1和互补子反应斑。但是,反应斑的大小有差异,Psg12菌株接种的病斑较大,477-1的较小,互补子1026-5的接近野生型菌株Psg12。病斑中细菌繁殖量分析表明,野生型菌株Psg12繁殖量最高,突变体477-1的最低,互补子1026-5的接近野生型菌株Psg12的繁殖量。[结论]hrpZ-Psg12基因能够增强大豆细菌性斑点病菌对大豆的致病性,并且能够在烟草上产生过敏性反应。     

三七细菌性叶斑病病原菌鉴定

[目的]对引起三七细菌性叶宽病的病原菌进行系统鉴定。[方法]以2011及2012年在云南文山及石林县的三七苗圃采集的三七细菌性叶斑病病株为材料,采用柯赫氏法则,检测分离菌株致病性并重新分离得到病原菌。通过病菌形态观察、致病性测定、16SrD—NA序列分析及生理生化特性分析（Biolog系统）对其进行鉴定。[结果]确定三七细菌性叶斑病病原菌为丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv．syringae）。[结论]该研究为三七细菌性叶瘫病菌详细鉴定的国内首报。     

烟草品种（品系）对野火病抗性评价

采用苗期针刺接种野火病菌的方法,对收集到的烟草品种（品系）进行抗性试验,结果表明,在38个测试的品种（品系）中,大体分为中抗、中感和感病3个抗性类群,其中,感病品种（品系）4个,该类群病情指数大于70;中感品种（品系）20个,该类群病情指数介于50～70;中抗品种（品系）14个,该类群病情指数介于20～50.在所有测试品种中,十里坪烟抗性最低,可作为对野火病监测预警材料;桦甸柳叶尖抗性最高,可作为今后的抗性亲本材料.     

猕猴桃溃疡病菌噬菌体的初步研究

以丁香假单胞菌猕猴桃致病变种为指示菌,从猕猴桃溃疡病病枝中分离到一株噬菌体,对该噬菌体进行了热稳定性、pH值稳定性、紫外线稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线等生物学特性的测定。结果表明:噬菌体的热稳定性较弱,在65℃下10 min内即可全部失活;在pH值4~9的范围内噬菌体均可稳定存在;紫外线下照射12 min,噬菌体几乎全部失活;噬菌体的最佳感染复数为0.1;感染指示菌的潜伏期约60 min,爆发期约70 min,烈解量为123。这是首次关于猕猴桃溃疡病菌噬菌体的报道。     

云南烟草野火病病原细菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)鉴定

 对云南省各大烟区烟草叶片上引起褪绿晕圈的病原细菌从形态学、培养性状、生理生化反应、抗菌素反应、抗血清反应、遗传性状等方面进行了鉴定。结果表明:该菌为烟草野火病菌［Pseudomonas syringae pv. tabaci Wolf &; Foser (1917) Young, Dye &; Wilkie (1978)］。     

烟草野火病菌hrpZ基因的克隆及蛋白的原核表达

采用PCR方法从烟草野火病病原菌Psta218中扩增harpin编码基因hrpZ,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,获得重组表达质粒pGEX-hrpZPsta。将重组质粒pGEX-hrpZPsta转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,得到重组大肠杆菌BL21/pGEX-hrpZPsta。经IPTG诱导得到14.7 kD的蛋白质。该蛋白质与其他已发现的harpins一样,能够使烟草等植物产生过敏性坏死反应、富含甘氨酸、热稳定以及对蛋白酶K敏感。