H9N2禽流感病毒纳米抗体酵母双杂交文库的构建

【目的】构建H9N2禽流感病毒（AIV）纳米抗体（Nbs）酵母双杂交文库,为后期筛选H9N2 AIV Nbs奠定基础。【方法】以H9亚型禽流感疫苗（F株）免疫双峰驼,当血凝抑制（HI）抗体滴度大于1∶2⁴时,颈静脉采集血液,分离淋巴细胞并提取淋巴细胞总RNA,用反转录试剂盒合成第一链cDNA,再以此为模板,通过巢式PCR扩增Nbs基因片段。将Nbs基因与pGADT7-Rec载体共转至Y187酵母感受态细胞,转化产物涂布SD/-Leu平板,30 ℃倒置培养约4 d,收集平板上的全部菌落,构建H9N2 AIV Nbs酵母双杂交文库,并对文库库容、滴度、重组效率和多样性进行鉴定。【结果】经H9亚型禽流感疫苗连续免疫4次后,双峰驼HI抗体滴度可达1∶2⁹;通过巢式PCR成功扩增出400 bp的Nbs基因。对构建的H9N2AIV Nbs酵母双杂交文库的鉴定表明,其库容为2.4×10⁸,滴度为4.2×10⁹ CFU/mL,插入重组率为95.6%;随机挑取10个克隆测序,结果显示均符合Nbs序列特征,且为独立克隆,表明文库多样性良好。【结论】成功构建了H9N2 AIV Nbs酵母双杂交文库,且文库各项指标均达到了要求。     

新城疫病毒V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

为构建新城疫病毒(NDV)V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒,用RNA试剂盒提取NDV F48E9株的RNA,通过反转录试剂盒将抽提的RNA反转录,以反转录合成的eDNA为模板,通过PCR扩增,获得V蛋白C端基因(VCTD).通过酶切连接的方法将V蛋白C端基因克隆至pGBKT7载体上,命名为pGBKT7-VCTD.将pGBKT7-VCTD转化酵母Y2H Gold酵母感受态细胞,转化产物涂布营养缺陷型平板,观察平板上菌落生长情况,判定诱饵质粒有无自激活能力:同时挑取平板上的生长的菌落接种液体培养基培养,绘制生长曲线,判定pGBKT7-VCTD诱饵质粒有无毒性.酶切和测序结果表明,成功构建pGBKT7-VCTD诱饵质粒,且该诱饵质粒在酵母细胞中无毒性和自激活能力.本研究成功构建了pGBKT7-VCTD诱饵质粒,为筛选NDVV蛋白C端纳米抗体奠定基础.