SD大鼠肾小管上皮细胞两种原代培养及传代方法的比较

目的：建立较理想的大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定方法。方法：采用肾小管节段贴块法及0．2％胰蛋白酶消化20min两种方法进行原代培养,以0．25％胰蛋白酶(A组)、0．125％胰蛋白酶-0．02％EDTA(B组)消化传代,利用免疫细胞化学方法鉴定细胞种类。结果：两种方法均能成功培养肾小管上皮细胞,但前者较好,小管节段贴壁早。B组成功传代(4代)并鉴定为肾小管上皮细胞,A组传代失败。结论：肾小管节段贴块、0．125％胰蛋白酶-0．02％EDTA消化是大鼠肾小管上皮细胞原代培养及传代的有效方法。     

奶山羊乳腺上皮细胞的体外培养及形态观察

【目的】建立奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法,并对原代和传代细胞进行形态观察。【方法】分别采用组织块法和胶原酶消化法培养奶山羊原代乳腺上皮细胞,然后通过胰酶消化法结合反复贴壁法纯化细胞,免疫组化法鉴定细胞,并利用倒置显微镜观察细胞形态。【结果】组织块法和胶原酶消化法均能培养奶山羊原代乳腺上皮细胞;纯化获得的细胞呈卵圆形或多角形,形成典型的鹅卵石或铺路石样,且细胞角蛋白检测呈阳性;多次传代后乳腺上皮细胞出现分化现象,形态多样,增殖仍然旺盛。【结论】成功建立了一种简单易行、经济而实用的奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法。     

两种奶牛真皮成纤维细胞分离培养方法的比较

为了比较两种体外分离和培养奶牛真皮成纤维细胞方法，采集奶牛蹄部真皮组织，通过组织块贴壁法和双酶消化法（胰蛋白酶-Ⅰ型胶原酶）分离原代奶牛真皮成纤维细胞，通过传代培养进一步纯化并扩增。利用显微镜观察细胞形态及生长特性，MTT法用于绘制细胞生长曲线，利用细胞免疫荧光技术检测其表面标志物，鉴定细胞纯度。倒置显微镜下观察，贴壁后第6天有细胞爬出，形态多呈长梭形，排列紧密呈漩涡状或束状；双酶消化组第2天有长梭形细胞生长，混杂少量上皮细胞生长。生长曲线图表示，组织块贴壁组细胞生长速度较快。免疫化学荧光检测第四代奶牛真皮成纤维细胞，波形蛋白呈阳性表达，角蛋白-18呈阴性表达，表示细胞纯度较高。两种方法均能分离出奶牛真皮成纤维细胞，与双酶消化法相比，组织块贴壁法分离的细胞纯度更高，活性更佳，增殖周期更短，提示组织块贴壁法是分离培养奶牛真皮成纤维细胞的首选方法。     

新生山羊肾小管上皮细胞的原代培养与鉴定

[目的]建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法.[方法]采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15 mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免...     

小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、原代培养及鉴定

目的:建立系统可靠的小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、培养、纯化及鉴定技术,为进一步研究肺纤维化及肺肿瘤等疾病的发病机制奠定基础.方法:应用低质量分数胰酶联合胶原酶的方法消化小鼠胎鼠肺组织块,经差速离心和差速贴壁的方法纯化肺泡Ⅱ型上皮,进行原代培养.用改良巴氏染色法和透射电镜观察对所分离的细胞进行鉴定.结果:每只胎鼠可获得(5±2)×106的细胞产量,细胞活力为95%±2%,纯度达到92%±2%,改良巴氏法镜下观察可见胞质内含较多深色颗粒,透射电镜观察到特征性的嗜锇小体即板层小体和细胞膜上有明显的微绒毛.结论:该方法能成功分离出小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞,且产量大、纯度高,能满足体外研究的需要.     

鸽小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

本试验旨在建立鸽小肠上皮细胞体外分离培养和鉴定的方法体系,为研究鸽小肠上皮细胞的营养转运吸收、细胞增殖代谢等机制提供原代细胞模型。采用胶原酶消化法和组织块贴壁法分离鸽小肠上皮细胞,并通过相差消化法对其纯化,最后运用免疫荧光分析和基因表达分析鉴定鸽小肠上皮细胞。结果表明,2种方法均可成功分离培养鸽小肠上皮细胞,细胞呈铺路石状排列;细胞角蛋白8免疫荧光染色呈阳性;紧密连接蛋白基因CLDN-3和CLDN-4均有表达;细胞生长曲线呈“S”形。综上所述,本试验成功建立了鸽小肠上皮细胞体外分离培养体系,为后续开展雏鸽肠道营养研究提供了细胞模型。     

鸡肠上皮原代细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡肠上皮原代细胞分离培养方法,进一步研究人源志贺菌对鸡的致病性和为相关侵袭特性提供体外模型,分别取不同日龄鸡胚,用0.1 g/mLⅠ型中性蛋白酶和300 U/mLⅪ型胶原酶联合分离纯化鸡肠上皮原代细胞,筛选其最佳培养方法,并对培养细胞进行鉴定;然后采用0.125％胰酶和0.01％ EDTA联合消化进行鸡肠上皮原代细胞传代.结果显示,应用Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型胶原酶消化15日龄鸡胚肠组织可获得满意的肠上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好.培养出圆形或多角形单层生长呈“铺路石样”的细胞,培养的细胞在12 h内贴壁,24 ～48 h明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,生长状况不良.经透射电镜观察鉴定为肠上皮细胞.且传代后细胞贴壁生长良好.建立的鸡肠上皮原代细胞分离培养方法可获得纯度较高的鸡肠上皮原代细胞,制备的细胞可以连续传代3次.     

4种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较

【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能力弱;嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法所获得的小鼠IECs纯度较高,原代培养时增殖能力稍弱于组织块培养法,但传代后增殖能力趋于稳定。通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的细胞进行鉴定,结果表明,分离的细胞多数为小鼠IECs。【结论】嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分离和培养。     

兔小肠上皮细胞体外分离培养

选用新生未哺乳仔兔,应用胶原酶Ⅳ消化法对小肠上皮进行分离培养,得到兔小肠上皮细胞后,联合应用相差消化法和相差贴壁法对兔小肠上皮细胞进行纯化。通过形态学观察及细胞免疫组织化学方法对所得到的纯化兔小肠上皮细胞进行鉴定。结果表明：应用胶原酶Ⅳ消化法得到的兔小肠上皮细胞生长状况良好,纯化后得到95％以上纯度的兔小肠上皮细胞,纯...     

兔成纤维细胞的分离与体外培养

用Ⅰ型、Ⅳ型胶原酶消化分离兔皮肤细胞,Ⅰ型胶原酶消化皮肤块获得的细胞数显著高于Ⅳ型胶原酶。用组织块直接培养法,也可以得到皮肤的原代培养细胞。２．５ｇ／Ｌ胰酶消化胎儿组织,可获得足够原代培养的细胞量。结合使用酶消化法和反复贴壁法,经２～３代后,可获得纯化的成纤维细胞。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。胎儿和皮肤成纤维细胞可分别传至第１３代与第１１代,传代后染色体数目不变。     

仔猪小肠黏膜上皮细胞体外分离培养及鉴定

 【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18（ETEC F18）引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1 的CDS区第307位点处的突变（G→A）,建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系（GG、GA和AA）。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上皮细胞分离效率对比表明,后一种消化方式更为有效。进而取出生12 h内未吃初乳的大白仔猪,剖腹剪取其小肠段,使用联酶混合液灌注消化分离得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。电镜和CK18免疫荧光染色结果均显示,小肠黏膜上皮细胞纯度达90%以上。经纯化处理,最后获得了FUT1基因型为GG和GA的两种小肠黏膜上皮细胞。仔猪原代小肠黏膜上皮细胞培养周期显示,7代前细胞生长状况良好,形态为典型的上皮细胞样,单层细胞呈铺路石排列,培养至第9代,细胞出现生长停滞、胞体空泡化等现象。【结论】最终获得了FUT1基因型为GG和GA的仔猪原代小肠黏膜上皮细胞。建立了仔猪小肠黏膜上皮细胞分离及培养方法,为后续的细胞建系工作奠定了良好的基础。     

牛蛙(Rana catesbeiana)腐皮红腿症病理学观察

【目的】观察牛蛙腐皮红腿症的病理学改变。【方法】通过石蜡切片,H.E染色法,对发生腐皮红腿症的牛蛙自然病例进行病理形态学变化观察。【结果】剖检发现病蛙头、背部皮肤腐烂,露出肌肉,腹部及腿部皮肤出血发红;肝肿大,严重充出血,呈花瓣状;脾、肾出血肿大,颜色加深;胃肠道黏膜出血发红,内充满大量淡黄色黏液。镜检以全身多组织器官充出血、实质细胞变性、坏死及炎症细胞浸润为主要特征,以皮肤肌肉、肝、脾、肾和胃肠道的变化最为明显。胃肠道表现为严重的出血性、卡他性炎症,胃肠黏膜上皮严重坏死、脱落;肝细胞严重空泡变性,并出现大面积坏死,肝间质充满大量炎症细胞;脾脏淋巴细胞、网状内皮细胞严重坏死;肾间质充血,肾小管上皮细胞广泛坏死,肾小球毛细血管严重充血。【结论】头背部体表皮肤溃烂,腹部及四肢出血,肝、脾、肾、胃肠道等多器官组织炎性病变是本病的示病症状。机体多器官组织严重病变是引起病蛙死亡的主要因素。     

马脐带间充质干细胞的分离培养与生物学特性研究

【目的】建立马脐带间充质干细胞（UC-MSCs）体外分离培养体系,研究其增殖能力、分化能力和生物学特性,为推广UC-MSCs在赛马运动损伤治疗方面的应用提供理论依据。【方法】采用I型胶原酶消化法从脐带组织分离马UC-MSCs,通过绘制生长曲线及计算群体倍增时间检测其体外增殖能力,结合流式细胞仪检测和RT-PCR扩增鉴定表面标志物（CD29、CD44、CD45、CD73、CD90和CD105）,并通过体外成脂成骨诱导分化检测其分化潜能。【结果】分离获得的原代马UC-MSCs为折光性强的圆形悬浮细胞,培养10 d后细胞融合达90%,且传代后细胞增殖速度明显提高,传代至P3代,细胞呈旋涡状生长,形态为均一的长梭形,生长趋势符合Logistic生长曲线规律,呈典型的S形。流式细胞仪检测结果显示,马UC-MSCs高表达CD29、CD44和CD90,表达率分别为98.45%、97.08%和96.56%,呈强阳性,但不表达CD45;RT-PCR扩增结果表明,马UC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等MSCs表面标志物基因,但不表达CD45基因。以胰岛素、IBMX、罗格列酮和地塞米松为主要试剂进行马UC-MSCs体外成脂诱导,诱导第10 d发现细胞内有小脂滴形成,至诱导第18 d有大量脂滴形成;选用抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松为主要试剂进行体外成骨诱导,至诱导第7 d可观察到钙结节形成。【结论】采用I型胶原酶消化法分离获得的马UC-MSCs纯度高,且具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能;掌握好马UC-MSCs的有效冻存方式,可为治疗赛马运动损伤提供优质的种子细胞。     

长大二元杂交猪胎儿成纤维细胞的生物学特性

【目的】研究长大二元杂交猪胎儿成纤维细胞的生物学特性。【方法】采用室温消化法从妊娠30d的长大二元杂母猪胚胎中分离胎儿成纤维细胞,利用MTT法检测第5、10、15、25、35、45、60、70代胎儿成纤维细胞的增殖能力,通过倒置显微镜观察不同代数的细胞形态,流式细胞仪分析细胞周期变化,DAPI染色观察细胞核染色质的形态以及衰老相关β-葡糖苷酶活性的染色测定等方法来判断细胞的衰老程度。【结果】①采用消化液室温消化法成功分离到猪胎儿成纤维细胞,细胞具有典型的成纤维细胞形态。②猪胎儿成纤维细胞于生长初期1～6d呈对数增长,此后进入平台期。【结论】随着细胞代数的增加,细胞的增殖能力虽有所下降,但仍然呈稳定的增长状态,各代次猪胎儿成纤维细胞生长良好。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

【目的】探索一种简单且高效的原代奶牛乳腺上皮细胞的培养方法。【方法】采用组织块培养法、酶消化法培养奶牛乳腺上皮细胞;通过MTT法检测吸光度绘制细胞生长曲线;通过免疫组化法鉴定角蛋白-18的表达。【结果】酶消化法相比组织块培养法获得的细胞具有耗时短,获得量高等优点,MTT法绘制的生长曲线符合一般生物学特性,呈"S"型,奶牛乳腺上皮细胞中角蛋白-18阳性表达。【结论】酶消化法是一种简单且高效的培养原代奶牛乳腺上皮细胞的方法。     

转KAP6.1-GFP-蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S 绵羊成纤维细胞株的筛选

 【目的】通过体细胞核移植为获得皮肤特异表达蜘蛛拖丝蛋白的绵羊奠定基础。【方法】将pcDNA3.1和带有角蛋白结合蛋白启动子质粒pGM-T-KAP6.1分别用Bgl Ⅱ和Hin d Ⅲ双酶切后连接,再与蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S连接,最后通过酶切与pIRES2-EGFP质粒连接后构建真核表达载体pIRES2-EGFP-4S;将此载体线性化后,采用脂质体法转染绵羊皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因阳性细胞。【结果】筛选得到转pIRES2-EGFP-4S的阳性细胞。对阳性细胞经体外培养后的检测显示：（1）细胞形态（长梭形）、细胞生长曲线（呈S形）、群体倍增时间（随培养时间增加逐渐缩短）和细胞接种率（细胞贴壁率及存活率在24 h内逐渐升高,并达到最高值125%）等均具有正常绵羊成纤维细胞的生物学特征;（2）阳性细胞经冷冻复苏后具有与新鲜阳性细胞相似的生物学特征;（3）PCR检测结果显示,pIRES2-EGFP-4S在阳性细胞的基因组中整合。【结论】获得具有在绵羊皮肤特异表达,且便于检测的转蜘蛛拖丝蛋白4S的绵羊成纤维细胞株。     

牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的真核表达及纯化

【目的】构建proEM-bPAG9重组表达载体,并在HEK293细胞中转染表达。为进一步抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研究奠定基础。【方法】通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体proEM中,构建proEM-bPAG9重组载体后转到DH5α感受态细胞中,重组质粒转染至哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达,再通过亲和层析纯化bPAG9重组蛋白(rbPAG9),经SDS-PAGE 和 Western Blot 检测rbPAG的表达效果。【结果】通过全基因合成法得到1 182 bp的bPAG9基因片段,构建的重组质粒proEM-bPAG9经双酶切获得约4 369 bp和1 176 bp的两条片段,与预期值相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致,氨基酸未发生突变;SDS-PAGE 和 Western Blot 鉴定显示,获得相对分子质量约为68 kDa 的bPAG9重组蛋白,通过Ni2+亲和层析纯化后,rbPAG9纯度可达90%。【结论】通过基因优化及真核表达获得分子质量为68 kDa 的rbPAG9重组蛋白。     

金黄色葡萄球菌诱导牛原代乳腺上皮细胞的凋亡

【目的】观察金黄色葡萄球菌能否诱导牛原代乳腺上皮细胞发生凋亡。【方法】先以新鲜牛奶为材料分离培养牛乳腺上皮细胞并鉴定,然后用金黄色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮细胞,采用普通光镜和扫描电子显微镜观察金黄色葡萄球菌诱导牛乳腺上皮细胞凋亡的形态学变化;用流式细胞仪（Annexin V/PI双染法）定量检测金黄色葡萄球菌感染对牛乳腺上皮细胞凋亡的诱导作用;RT-PCR检测细胞凋亡通路中关键蛋白caspase 3和caspase 8的变化情况。【结果】从乳汁中分离的细胞经原代培养后,细胞呈典型的铺路石状,细胞表层可产生大小不等的乳滴,RT-PCR法扩增出乳腺上皮细胞的骨架蛋白8特异性条带;免疫荧光细胞染色法结果显示分离培养的牛乳腺上皮细胞表达角蛋白8;金黄色葡萄球菌感染牛乳腺上皮细胞3 h后,可诱导牛乳腺上皮细胞发生凋亡,表现为细胞核皱缩,染色质边缘化和细胞浆内空泡增多等典型凋亡特征;Annexin V/PI双染法检测后发现,与对照组相比,感染组细胞凋亡率明显升高,差异极显著（P﹤0.01）;与对照组相比,感染组细胞caspase3及caspase 8表达量明显增高。【结论】金黄色葡萄球菌可以诱导牛原代乳腺上皮细胞凋亡,具有细胞凋亡的典型形态特征和生化特性,凋亡通路可能涉及caspase 3和caspase 8参与的外源性凋亡途径。     

酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)基因表达的影响

【目的】探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的调节作用,为在分子水平上揭示益生菌对防御素的调控机理提供一定的理论基础及依据。【方法】首先将新鲜的绵羊瘤胃组织用PBS和抗生素处理后进行瘤胃上皮细胞原代培养,当原代细胞数量长到细胞培养瓶的85%以上时,将细胞传于12孔板用于细胞刺激试验。同时将活化并纯化后的酿酒酵母菌25℃、180 r/min有氧培养48 h后,进行5次平行平板计数试验,根据平板计数的数据处理方法,得到浓度为5.2×108CFU·m L-1的酿酒酵母菌液,再通过倍比稀释把所得菌液依次稀释成浓度为5.2×107、5.2×106、5.2×105、5.2×104CFU·m L-1的菌液,用以上不同浓度(5.2×104—5.2×108CFU·m L-1)的酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞分别进行不同时间(2、4、8、12、24 h)的刺激,并设置对照组用DMEM/F12培养基代替酿酒酵母菌。然后提取总RNA,逆转录为c DNA后,利用实时荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测瘤胃上皮细胞中SBD-1表达差异。最后用SAS 9.2软件对数据进行相关差异性分析。【结果】荧光定量PCR结果表明,在各时间组内SBD-1 m RNA的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势,当菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1时表达量达到最大,并与对照组和其他浓度组相比差异极显著(P0.01)。当菌液浓度一定时,SBD-1 m RNA的表达量先是随着刺激时间的延长而呈上升趋势,刺激时间为12 h时SBD-1 m RNA表达量达到峰值,之后呈下降趋势。因此,当浓度为5.2×107CFU·m L-1的菌液刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1基因的表达量达到最高,且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著(P0.01)。ELISA检测结果显示,SBD-1蛋白表达趋势与SBD-1 m RNA检测结果基本一致。不同浓度的菌液分别刺激绵羊瘤胃上皮细胞2、4、8、12、24 h后均能提高共培养上清中SBD-1蛋白的表达,且与对照组相比存在极显著差异(P0.01)。在菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后SBD-1蛋白分泌水平达到最高,与此浓度下各时间组相比差异极显著(P0.01)。【结论】酿酒酵母菌能够提高绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1的表达量达到最高。     

高温条件下miRNA-24对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的非编码小RNA分子,本研究旨在分析高温条件下miRNA-24对乳腺上皮细胞生长、凋亡的作用及其初步机制。【方法】体外培养奶牛乳腺上皮细胞,高温(41℃)处理所培养的细胞;应用miRNA基因沉默技术,抑制高温处理过的乳腺上皮细胞中miRNA-24的表达;采用细胞计数法分析细胞增殖情况;Hoechst33342/PI荧光染色、流式细胞术检测miRNA-24对乳腺上皮细胞凋亡的作用,Western blot检测凋亡相关因子表达变化。【结果】抑制miRNA-24的表达,高温条件下的乳腺上皮细胞增殖能力显著增强(P0.05),凋亡细胞数显著减少(P0.05),促凋亡因子caspases-8和caspases-3表达量下调。【结论】内源性miRNA-24对乳腺组织发育具有重要的调控作用,抑制miRNA-24的表达可以缓解高温诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡发生率、促进细胞的生长发育。