鸡胚小肠上皮细胞的分离培养及其热应激效应

【目的】比较不同消化酶对鸡胚小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)的分离和培养效果及细胞的热应激能力,为后续研究提供依据。【方法】以15日龄鸡胚为研究对象,分别使用0.5 g/L胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合及中性蛋白酶Ⅱ消化分离其小肠上皮细胞。培养不同时间后,观察IECs的生长状态,测定细胞生长活性;通过免疫荧光染色和免疫组化对所得IECs进行鉴定,确定最佳的消化酶。对优化所得鸡胚IECs于42℃分别进行2,3,4 h热应激处理,以37℃处理的IECs为对照,MTT法和流式细胞测定IECs的相对活力和凋亡率。【结果】细胞形态学观察发现,用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离得到了大量小肠绒毛隐窝团块,易贴壁,细胞生长快;用0.5 g/L胰蛋白酶和中性蛋白酶Ⅱ消化分离得到的细胞数量少,贴壁慢。用3种酶消化方法分离的细胞生长曲线均呈"S"形,但用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离的细胞生长曲线峰值较高,细胞活性强;联合消化所得IECs特异性标记抗原均为阳性,免疫荧光阳性率达(92.7±7.9)%,细胞膜质呈棕黄色,而对照组细胞膜质无着色。42℃下热应激3 h后细胞活力极显著下降,凋亡率为(35.96±1.57)%,极显著高于对照组的(0.67±0.02)%,可进行后续试验。【结论】采用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化可得到IECs;42℃下处理3 h是构建IECs热应激模型的条件。     

鸡肠上皮原代细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡肠上皮原代细胞分离培养方法,进一步研究人源志贺菌对鸡的致病性和为相关侵袭特性提供体外模型,分别取不同日龄鸡胚,用0.1 g/mLⅠ型中性蛋白酶和300 U/mLⅪ型胶原酶联合分离纯化鸡肠上皮原代细胞,筛选其最佳培养方法,并对培养细胞进行鉴定;然后采用0.125％胰酶和0.01％ EDTA联合消化进行鸡肠上皮原代细胞传代.结果显示,应用Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型胶原酶消化15日龄鸡胚肠组织可获得满意的肠上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好.培养出圆形或多角形单层生长呈“铺路石样”的细胞,培养的细胞在12 h内贴壁,24 ～48 h明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,生长状况不良.经透射电镜观察鉴定为肠上皮细胞.且传代后细胞贴壁生长良好.建立的鸡肠上皮原代细胞分离培养方法可获得纯度较高的鸡肠上皮原代细胞,制备的细胞可以连续传代3次.     

山羊卵巢间质细胞分离方法的比较

【目的】比较体外条件下不同分离山羊卵巢间质细胞(ovarian interstitial cells)方法的效果。【方法】采用热消化法、冷消化法、单一酶消化法(热消化法,用Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅺ型胶原酶和2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA)及2步酶消化法分离山羊卵巢间质细胞。【结果】热消化法得到的细胞数量较冷消化法多,且试验所用时间缩短,但细胞活率降低。单一酶热消化法中,以1g/LⅪ型胶原酶效果最佳,适合体外培养。2步酶消化法以先胰蛋白酶后Ⅺ型胶原酶组的效果最佳,卵巢组织消化时间及体外培养首次换液时间均较短,适合于体外培养。【结论】采用1g/LⅪ型胶原酶单一酶热消化法或先胰蛋白酶后Ⅺ型胶原酶2步酶消化法,分离山羊卵巢间质细胞的效果均较好,可作为试验用卵巢间质细胞的理想分离方法。     

兔成纤维细胞的分离与体外培养

用Ⅰ型,Ⅳ型胶原酶消化分离兔皮肤细胞,Ⅰ型胶原酶消化皮肤块获得的细胞数显著高于Ⅳ型胶原酶。用组织块直接培养法,也可以得到皮肤的原代培养细胞,２．５ｇ／Ｌ胰酶消化胎儿组织,可获得足够原代增减２的细胞量。结合使用酶消化法和反复贴壁法,经２－３代后,可获得纯化的成纤维细胞。     

兔成纤维细胞的分离与体外培养

用Ⅰ型、Ⅳ型胶原酶消化分离兔皮肤细胞,Ⅰ型胶原酶消化皮肤块获得的细胞数显著高于Ⅳ型胶原酶。用组织块直接培养法,也可以得到皮肤的原代培养细胞。２．５ｇ／Ｌ胰酶消化胎儿组织,可获得足够原代培养的细胞量。结合使用酶消化法和反复贴壁法,经２～３代后,可获得纯化的成纤维细胞。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。胎儿和皮肤成纤维细胞可分别传至第１３代与第１１代,传代后染色体数目不变。     

牛乳腺上皮细胞的分离培养

比较了几种乳腺细胞分离培养方法的特点。实验证明：胶原酶消化法和组织块种植法均可用于培养牛原代乳腺细胞。其中,胶原酶消化法容易得到均匀的乳腺细胞,且上皮细胞所占比例也比较高;组织块培养法不容易丢失、损伤上皮细胞,但上皮细胞长出较晚,且占比例较低,然而,用于培养小动物乳腺组织具有优势,并且可结合组织块转移、胰蛋白酶消化纯化上皮细胞,用此方法本实验获得了牛乳腺上皮细胞富集的细胞系;同时讨论了乳腺上皮细胞增殖与分化的关系,提出终末分化的腺上皮细胞已不再分裂增殖的观点。     

奶山羊乳腺上皮细胞的体外培养及形态观察

【目的】建立奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法,并对原代和传代细胞进行形态观察。【方法】分别采用组织块法和胶原酶消化法培养奶山羊原代乳腺上皮细胞,然后通过胰酶消化法结合反复贴壁法纯化细胞,免疫组化法鉴定细胞,并利用倒置显微镜观察细胞形态。【结果】组织块法和胶原酶消化法均能培养奶山羊原代乳腺上皮细胞;纯化获得的细胞呈卵圆形或多角形,形成典型的鹅卵石或铺路石样,且细胞角蛋白检测呈阳性;多次传代后乳腺上皮细胞出现分化现象,形态多样,增殖仍然旺盛。【结论】成功建立了一种简单易行、经济而实用的奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法。     

秦川牛胎儿骨骼肌卫星细胞的分离培养

【目的】探索胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、鉴定及基因转染的方法。【方法】分别采用Ⅰ型胶原酶消化、Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化及链霉蛋白酶消化法对胎牛骨骼肌卫星细胞进行培养,比较了3种不同分离方法所得细胞数及其存活率的差异;利用差速贴壁法和Percoll密度梯度离心相结合的方法纯化骨骼肌卫星细胞,对纯化后的细胞进行myostatin基因RT-PCR以及结蛋白(Desmin)免疫细胞化学染色鉴定,最后通过电转染法对纯化的骨骼肌卫星细胞进行EGFP基因转染研究。【结果】3种消化培养方法中,以链霉蛋白酶消化法分离得到的胎牛骨骼肌卫星细胞数显著高于其它2种方法(P0.05),但细胞存活率较低(P0.05);而采用Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化法可以得到相对较高的细胞数及存活率。利用差速贴壁和Percoll密度梯度离心相结合的方法可以得到纯化的骨骼肌卫星细胞;电转染法适用于骨骼肌卫星细胞的基因转染。【结论】建立了胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、纯化、鉴定及基因转染的方法,为通过转基因方法改良秦川牛产肉性能研究奠定了基础。     

小鼠子宫内膜上皮细胞体外培养方法比较

为探讨适用于小鼠子宫内膜上皮细胞的培养方法,对胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶消化+刮取法、Ⅰ型胶原酶消化法、Ⅰ型胶原酶消化法+刮取法、子宫翻转组织块培养法5种方法进行了比较研究.结果表明,胰蛋白酶消化法获得的上皮细胞数量稀少,活力低,生长速度缓慢;刮取法+胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、刮取法+Ⅰ型胶原酶消化法获得的细胞数量较单纯胰蛋白酶消化法多,但达不到研究所需的要求;子宫翻转组织块培养法获得的上皮细胞活力强,生长速度快,纯度高,比较适宜小鼠子宫内膜上皮细胞的原代培养.     

小白鼠乳腺上皮细胞的体外培养

本试验对小白鼠乳腺上皮细胞的原代培养方法进行了探索。胶原酶消化法和组织块种植法均可用于培养小白鼠原代乳腺细胞。胶原酶消化法容易得到均匀的乳腺细胞，且上皮细胞所占比例也比较高。组织块种植法不容易丢失、损伤上皮细胞，然而上皮细胞长出较晚，且占比例较低。结果表明，可结合组织块转移、胰蛋白酶消化纯化上皮细胞。     

一类分数阶微分方程多点共振边值问题的可解性

利用重合度理论,研究了一类阶数为α（n-1〈α     

甲鱼养殖废水作为温室番茄栽培灌溉用水的效果研究

针对甲鱼养殖废水排放所造成的环境负荷、资源浪费和温室栽培灌溉的大量用水需求，采用塑料温室栽培试验方法，研究了将甲鱼养殖废水作为温室樱桃番茄栽培灌溉用水的可行性和效果。试验中养殖废水与自来水混合的比例设为：0、50％和100％，栽培试验在无基肥和添加基肥两种情况下进行。结果显示．无基肥添加时，用100％养殖废水灌溉番茄时对其茎粗生长和产量的促进作用明显，番茄茎粗比用纯自来水灌溉的增大约8．6％，产量增加24％左右。50％的养殖废水灌溉效果介于纯甲鱼废水和纯自来水之间；添加基肥时，用50％养殖废水灌溉的番茄茎粗比纯自来水灌溉的增大6％左右，50％和100％养殖废水灌溉情况下的番茄收获量在6月底基本相同，比用纯自来水灌溉的增加约3．8％。养殖甲鱼废水中的养分能部分供给作物生长需要，对有、无基肥添加情况下的樱桃番茄生长都显示出一定的促进作用，但养殖废水的稀释程度对作物生长效果要根据栽培基质的养分管理不同而定。     

国内魔芋栽培模式研究进展

通过简述魔芋生长环境需求特性,总结魔芋庭院栽培、净作栽培、大田间套作栽培、林下栽培、轮作栽培及保护地栽培等栽培模式研究进展,分析各种栽培模式的优缺点.提出了今后应从广泛开展魔芋种质资源收集、鉴定、评价与利用,构建魔芋间套作、轮作栽培新模式,提高魔芋种植全程机械化、自动化水平,扩大魔芋种植范围,创建有机栽培模式等方面改进...     

黑龙江地区影响花生产量的栽培技术研究

通过对黑龙江齐齐哈尔地区几种花生种植方式进行比较分析,从而得到适合齐齐哈尔地区花生栽培的方法,达到提高该地区花生产量的目的.     

南京地区西瓜秋延迟栽培技术研究

为延长西瓜供应时间,实现反季节上市,提高大棚利用率,研究了南京地区西瓜秋延迟栽培技术。结果表明:‘早佳8424’和‘小兰’为最适宜南京地区秋延迟栽培的中型和小型西瓜品种;采用地爬式栽培,西瓜单果重,商品性好,投资较小;采用吊蔓栽培,栽培密度大,西瓜亩产高;种苗8月上旬定植,生长期避开高温,利于高产增收。     

不同配方基质对豆角生长效应的影响

为探究适宜豆角种植的基质原料筛选,于2020年7月份在河北省邢台市威县晟熙农业科技温室大棚中进行豆角种植试验,共研究了5中不同基质原料（白菇渣：蛭石：珍珠岩=6:3:2的A1基质;发酵料：蛭石：珍珠岩=6:3:2的A2处理;平菇渣：蛭石：珍珠岩=6:3:2的A3处理;金针菇渣：蛭石：珍珠岩=6:3:2的A4处理;麦糠：蛭石：珍珠岩=6:3:2的A5处理）下豆角出苗率与生长效果的影响。结果表明,A3处理基质的出苗率最快,可以较好满足豆角种子发芽;且A3、A5、A2均能够促进豆角植株的快速生长;因此,平菇渣、麦糠、发酵料可作为基质产品的首先原料,可为今后基质生产提供参考价值。     

一类新的混合分数阶可微变分不等式的拓扑处理方法

在可微变分不等式和分数阶可微变分不等式的基础上首次引进和研究了一类新的混合分数阶可微变分不等式.给出了这类新的混合分数阶可微变分不等式的模型,并详细地说明了模型中的符号所代表的数学意义,证明了该模型的解集是非空的.     

福建冬种马铃薯生产技术研究

通过全面调查福建冬种马铃薯生产情况,以及对冬种主产区气温、降雨量、蒸发量等气象资料分析,结合马铃薯新品种与种植密度的比较试验结果,初步总结出福建冬种马铃薯种植范围、种植时间和高产栽培技术,为进一步发展冬种马铃薯生产提供参考。     

毛豆——水稻轮作高产栽培技术

明溪县推广毛豆一水稻轮作栽培模式,经济效益明显。分析了该模式的优点,并总结了毛豆一水稻轮作模式的栽培技术。     

干旱及半干旱地区不同播种处理方式对纤维高粱产量及其相关性状的影响

为促进纤维高粱栽培技术的进步,以龙笤1号纤维高粱为试材,采用小区试验,研究干旱、半干旱地区纤维高粱不同播种处理方式对产量性状和工艺性状的影响。结果表明:磷酸二铵和种子活化剂播种时加入坐水的水罐中对增加产量作用明显,合理调配肥料和活化剂、抗旱种衣剂的使用,不仅能增加纤维高粱的产量,且工艺性状明显好于对照。