犬瘟热疫苗株CDV3核蛋白基因全序列测序及分析

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒(CDV)核蛋白(N)蛋白基因序列,设计合成了1对寡聚核苷酸引物,提取犬瘟热病毒疫苗株CDV3的RNA为模板,采用RT-PCR扩增病毒的N蛋白基因,并进行产物克隆和序列分析。将CDV3疫苗株N基因与GenBank数据库中的疫苗株Onderstepoort及中国、美国和德国等分离的疫苗株或毒株共14株CDV N基因序列进行同源性分析,发现CDV3 N基因序列与疫苗株Onderstepoort的同源性为97.1%,与其他分离毒株的核苷酸同源性为92.8%～94.0%,其中与中国分离的TN株同源性为93.6%;然而,CDV3 N蛋白与它们的氨基酸同源性却基本都为96.6%～97.3%。这说明虽然犬瘟热弱毒株CDV3在核苷酸水平上与其他疫苗株毒株的差异较大,但是在氨基酸水平上的比较差异较小。     

犬瘟热病毒貉、狐、貂分离株N蛋白基因的遗传多样性和功能分析

为分析从不同地区分离的犬瘟热病毒(CDV)毒株的抗原性差异,对5个CDV分离株和1个CDV弱毒疫苗株的N蛋白基因进行了核苷酸测序,并与11个参考毒株进行了比较。结果表明,5个分离株之间核苷酸序列同源性达94.5%-99.8%。China(国内疫苗株)与分离株的核苷酸序列同源性普遍较低(90.9%-93.5%)。分离株之间氨基酸序列同源性差别大(87.9%-100%),其中,HT-P与THD1的氨基酸序列同源性为100%;而与China疫苗株氨基酸同源性普遍较低,为89.7%-91.8%。China疫苗株与Onderstepoort有着很高的同源性,同源性比例分别为97.1%。分析结果显示,最近CDV的流行和免疫失败现象发生,与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关。     

犬瘟热病毒水貂分离株H基因的遗传多样性分析

以犬瘟热病毒水貂分离株的RNA为模板,对分离株的H基因进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后与pMD-18T Sim-pie Vector连接,成功地构建了克隆质粒pMD-18T-CDVH.序列分析表明,分离株H基因由1 596 bp组成,编码532个氨基酸,含有5个潜在的N-联糖基化位点,12个半胱氨酸残基.与已发表的24株CDV毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性在90.7%～98.6%之间:推导的氨基酸序列同源性在89.9%～97.O%之间.与Onderstepoort、Convac、Hamatsu,A75/17、TN株相比,根据推导的氨基酸序列比较分析表明,N-联糖基化位点的数目与位置均存在差别.聚类分析结果表明分离株与Snyder Hill毒株的亲缘关系最近,二者与疫苗株Onderstepoort和Convac具有较高的同源性,组成一组,而与标准野毒强毒株Hamatsu的亲缘关系较远. 个半胱氨酸残基.与已发表的24株CDV毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性在90.7%～98.6%之间:推导的氨基酸序列同源性在89.9%～97.0%之间.与Onderstepoort、Convac、Hamatsu,A 5/17、TN株相比,根据推导的氨基酸序列比较分析表明,N-联糖基化位点的数目与位置均存在差别.聚类分析结果表明分离株与Snyder Hill毒株的亲缘关系最近,二者与疫苗株Onderstepoort和Convac具有较高的     

貂、狐、貉源犬瘟热病毒分离株H和N基因的遗传多样性分析

为研究鼬科动物犬瘟热病毒(CDV)毒株的变异特性,对来自不同地区的貉、狐、貂的5个CDV分离株(其中HD-m、LN-m为貂源,HTp-r、THD1-r为貉源,HB-f为狐源)和1个CDV国内弱毒疫苗株(vCh)的N基因和部分H基因进行了核苷酸测序,并构建系统发生树.结果表明,5个分离株之间H基因核苷酸序列同源性均达到97.5%以上,而N基因为94.5%～99.8%.vCh与5个分离株的H基因和N基因核苷酸序列同源性普遍较低(H基因:90.5%～91.8%;N基因:90.9%～93.5%),而与国外疫苗株vCon和vOnder的H基因核苷酸同源性达96.8%和97.2%.分离株之间H蛋白氨基酸同源性差别不大(97.1%～100%),而N蛋白氨基酸同源性差别较大(91.6%～100%).5个CDV分离株与vCh疫苗株H蛋白和N蛋白同源性均普遍较低,H蛋白为89.7%～91.8%,N蛋白为92.8%～96.8%.vCh与vOnder、vCon有很高的同源性,其H蛋白氨基酸同源性分别为97.1%和95.6%,vCh与vOnder N蛋白氨基酸同源性达97.3%.结果显示,最近犬瘟热的流行和免疫失败现象的发生与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关.     

貂、狐、貉源犬瘟热病毒分离株H和N基因的遗传多样性分析

为研究鼬科动物犬瘟热病毒(CDV)毒株的变异特性,对来自不同地区的貉、狐、貂的5个CDV分离株(其中HD-m、LN-m为貂源,HTp-r、THD1-r为貉源,HB-f为狐源)和1个CDV国内弱毒疫苗株(vCh)的N基因和部分H基因进行了核苷酸测序,并构建系统发生树.结果表明,5个分离株之间H基因核苷酸序列同源性均达到97.5%以上,而N基因为94.5%～99.8%.vCh与5个分离株的H基因和N基因核苷酸序列同源性普遍较低(H基因:90.5%～91.8%;N基因:90.9%～93.5%),而与国外疫苗株vCon和vOnder的H基因核苷酸同源性达96.8%和97.2%.分离株之间H蛋白氨基酸同源性差别不大(97.1%～100%),而N蛋白氨基酸同源性差别较大(91.6%～100%).5个CDV分离株与vCh疫苗株H蛋白和N蛋白同源性均普遍较低,H蛋白为89.7%～91.8%,N蛋白为92.8%～96.8%.vCh与vOnder、vCon有很高的同源性,其H蛋白氨基酸同源性分别为97.1%和95.6%,vCh与vOnder N蛋白氨基酸同源性达97.3%.结果显示,最近犬瘟热的流行和免疫失败现象的发生与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关.     

IBV陕西分离株M基因的克隆与遗传变异分析

为了研究IBV陕西分离株M基因的遗传变异情况及分子特征,参照NCBI所登录的IBVM基因序列设计了1对引物,应用RT-PCR方法对陕西8株IBV分离株的M基因进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行核苷酸序列及氨基酸序列同源性和进化发生关系分析,并对M蛋白的二级结构和跨膜区进行预测。结果表明,8个IBV分离株间的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸同源性分别为92.3%~99.8%和95.4%~100%,分离毒株与参考毒株的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸序列同源性分别为87.4%~99.5%和89.4%~99.5%;分离毒株与参考毒株M蛋白的α-螺旋结构主要分布在N端前100氨基酸肽段区,其他的部分主要是β-折叠和无规则卷曲结构;分离毒株的M蛋白均包含有3个跨膜区。表明IBV分离株M蛋白在基因序列和二级结构上相对保守。     

貂、貉源犬瘟热病毒流行毒株H基因的克隆及遗传多样性分析

为研究鼬科动物犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)毒株的变异特性,对分离自不同地区貉、貂的5个CDV毒株和1个CDV国内弱毒疫苗株(vacChina)的H基因进行了核苷酸测序,并与12个参考毒株构建系统发生树。结果表明:5个流行毒株之间H基因核苷酸序列同源性均达到97.5%以上,vacChina与5个流行毒株的H基因核苷酸序列同源性普遍较低(90.5%～91.8%),而与国外疫苗株Convac和Onderstepoort的H基因核苷酸同源性达96.8%和97.2%。流行毒株之间H蛋白氨基酸同源性差别不大(97.1%～100.0%),流行毒株与vacChina疫苗株H蛋白氨基酸同源性普遍较低(89.7%～91.8%),vacChina与Onderstepoort、Convac有着很高的同源性,其H蛋白氨基酸同源性分别为97.1%、95.6%。结果分析显示,CDV的流行和免疫失败现象的发生与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关。     

鸡新城疫病毒洛阳分离株HN基因的克隆和序列分析

应用RT PCR技术从新城疫病毒洛阳分离株中扩增HN的cDNA片段,并将其克隆至pMD18 T载体进行核苷酸序列测定。结果表明:新城疫分离株HN基因片段长度为1716bp,编码571个氨基酸;推测出的氨基酸序列中有5个糖基化位点,12个半胱氨酸残基;与国内外的14株新城疫毒株HN基因相比,核苷酸和氨基酸同源性分别为66.4%~98.5%和87.8%~98.3%;与标准毒株Lasota和Clone30的亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸差异性较大,而与天津分离株和云南分离株的亲缘关系较近,基本属于同一基因群。     

狐貉源犬瘟热病毒核蛋白基因的克隆及序列比较分析

参照已发表的犬瘟热病毒(CDV)核蛋白基因(N)序列设计合成了1对引物,用RT-PCR方法对从发病狐、貉中分离的MS01、SC01、ZD01三株CDV的N基因进行扩增,并分别将其PCR产物进行克隆和测序。测序结果表明:3病毒分离株N基因阅读框架全长均为1572bp,编码523个氨基酸。利用DNAstar的MegAlign生物软件,将3病毒分离株与Genbank数据库中现有的CDV毒株的N基因序列及推导出的氨基酸序列进行了同源性比较和系统进化树分析,结果发现:3病毒分离株与强毒参考株A75/17等野毒株高度同源,核苷酸同源为96.2%～99.1%,氨基酸同源为96.0%～99.8%,而与疫苗株Onderstepoor相对较远,核苷酸同源为93.6%～94.0%。N基因的系统进化关系分析显示:3病毒分离株均归为强毒株,并且与中国新疆的TN株、中国台湾的Kaohsiung株基因型最近,表现出一定的地理位置相关性。     

犬瘟热病毒扬州分离株融合蛋白F和附着蛋白H基因的序列分析

根据Genbank犬瘟热病毒(CDV)毒株序列分别设计融合蛋白F和附着蛋白H全基因的2对引物,以2个CDV扬州分离株(CDV-YZ0101、CDV-YZ0102)为模板RT-PCR扩增出H基因和F基因2个片段,将其克隆进pGEM-Teasy载体,并进行序列分析.结果表明H基因的开放阅读框架(ORF)为1 824 bp,2种分离株间核苷酸和编码氨基酸同源性达98%左右,与中国长春分离株、美国、日本分离株的同源性分别为96%、93%～95%和90%～91%.氨基酸分析显示扬州分离株与其他分离株的H蛋白有8～9个可能的天冬酰胺糖基化位点,而OP-CDV疫苗株只有4个类似位点.扬州分离株与长春分离株同属一个系,与美国、日本分离毒株以及疫苗株相比,均存在着明显的差异.F基因ORF为1 989 bp,不同毒株间的核苷酸及编码氨基酸差异主要表现在信号肽区域,而编码的F0前体蛋白表现出较高同源性(97%～99%),且所有的13个半胱氨酸残基、4个可能的天冬氨酰糖基化位点和2个疏水区域均完全一致.因此CDV F与H蛋白基因相比有很高的同源性,证明中国分离株与国外参考株有差异.     

野鸭源H3N8亚型禽流感病毒NS基因的分子克隆及序列分析

根据GeneBank上已发表的H3N8亚型禽流感的非结构蛋白基因(NS)序列,设计了一对特异性引物,成功地从A/mallard/SanJiang/167/2006(H3N8)中克隆到NS基因序列,该克隆基因全长860 bp,编码NS1和NS2两种非结构蛋白.与其他H3N8亚型的NS基因进行了同源性比较,核苷酸同源性为65.5%～98.3%,推导的氨基酸序列同源性为65.4%～97.8%.NS基因遗传进化树形成两个分支,该分离株处于等位基因B组.另外,此毒株NS基因在263～277位没有发生15个碱基的缺失.A/mallard/SanJiang/167/2006(H3N8)株149位为丙氨酸,其不能感染哺乳动物.     

伪狂犬病毒Fa株gB、gC、gD基因的克隆与序列分析

对猪伪狂犬病病毒闽A株(Fa株)gB、gC、gD基因进行了克隆和序列测定,结果表明:gB、gC、gD基因序列全长分别为2 745 bp、1464 bp、1 215 bp,编码914、487、404个氨基酸残基组成的多肽。序列分析结果显示:Fa株与其他毒株gB、gC、gD基因核苷酸序列的同源性为94.9%~99.9%,氨基酸序列的同源性为91.4%~99.9%。不同PRV毒株gB、gC、gD基因在核苷酸和氨基酸水平上高度保守。基于gB、gC、gD基因的进化树分析表明,中国分离毒株与韩国分离毒株可归为一个进化分支,而日本分离株与欧美分离株归为另一个分支。在前一个分支里,闽A株与鄂A株的亲缘关系特别近,3个基因的同源率均在99.5%以上。在gB蛋白氨基酸序列全长上中国分离株(Ea株、Fa株)比欧美分离株多了1个氨基酸,氨基酸残基的突变主要集中在第50~100氨基酸。在gC基因序列第186~211 bp,Ea株、Fa株比欧美分离株多插入了21个碱基。在gD蛋白氨基酸序列全长上,Ea株、Fa株比其他分离株多了2~6个氨基酸。在gD基因序列第803~837 bp,Fa株核苷酸AGGCCC串联重复最多,达到7个。     

2010年云南PRRSV分离株ORF5基因的遗传变异分析

 为了了解云南猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的遗传变异情况及其与猪繁殖与呼吸综合征的分子流行病学关系,对2010年分离到的10个云南PRRSV流行毒株进行了ORF5基因序列的测定与分析。结果显示云南分离株与中国大陆首次分离株CH1a,北美代表株VR2332和欧洲型代表株LV之间的核苷酸同源性分别为93.2%-94.2%,87.4%-89.6%和62.5%-64.0%;氨基酸同源性为90.0-91.5%,87.1-88.6%和51.7-57.7%。遗传进化分析显示,云南10株分离株属于美洲型,并分为两个基因亚型。与传统毒株相比,云南分离株ORF5基因及其推导的氨基酸的变异主要以点突变为主,但关键氨基酸位点未见明显改变,表明目前云南省所流行的PRRSV仍以经典毒株为主。研究结果为云南猪繁殖与呼吸综合征的控制提供了依据。     

传染性法氏囊病病毒的分离及其VP2高变区序列的比较

[目的]从病鸡中分离传染性法氏囊病病毒(IBDV),并对其VP2基因高变区序列进行比较。[方法]采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种SPF鸡胚的方法分离到2株IBDV。对分离株(vVP2)进行扩增和序列测定,分析分离株的关键氨基酸位点特征,并与参考毒株相应序列进行同源性比较。[结果]2株分离株特征性位点的氨基酸为222A、249Q、254G、256I、279D、284A、294I和299S,属于wIB-DV的特征,与wIBDV参考株具有较高的同源性,其核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%～97.0%和98.7%～99.4%。从遗传进化树来看,2个分离株与参考的vvIBDV也在一个分支。此外,2个分离株表现出与该鸡场常用的疫苗株MB有较高的同源性,其核苷酸和氨基酸同源性分别为96.8%和98.1%,并在遗传进化树中同属于一个大分支,但其特征性位点的氨基酸明显不同。在其他氨基酸位点上,2个分离株均发生了D212N的特有变化。[结论]该鸡群感染的IBDV具有vvIBDV的分子特征,并发生了与疫苗株和参考株不同的分子变化。     

番鸭催乳素基因的克隆与序列分析

为探明番鸭的遗传分化,以番鸭脑垂体的总RNA为模板,用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增了含有催乳素(PRL)基因的DNA片段,将其克隆到pMD18-T载体上并进行了序列分析.结果表明,番鸭PRL基因由765 bp组成,编码229个氨基酸;与已报道的北京鸭、马岗鹅、皖西白鹅、莱茵鹅、家鸡、火鸡、鹌鹑等禽类PRL基因相比,PRL基因的核苷酸和氨基酸序列同源性为91.0%-99.0%和98.3%-99.1%.说明PRL基因在进化过程中相当保守.番鸭PRL基因氨基酸序列与北京鸭比较两者并没有太大差别,仅在第9(K/E)、176(V/I)、194位(K/I)各有一个突变,可以推测这两者之间就巢性的差异可能与PRL的结构关系不大;但与家鸡的氨基酸序列差异则较大.     

山东小麦黄花叶病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR对2012年山东10个地区送检的105个小麦样品进行了检测,从泰安、临沂、枣庄3个地区的样品中检测到了小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)。这3个地区WYMV分离物CP基因的核苷酸一致率为97.6%～98.3%,氨基酸一致率为98.3%～99.0%。在利用CP基因核苷酸序列构建的系统进化树中,这3个分离物均与WYMV分离物聚类到一起,其中枣庄分离物和河南分离物(FR828007)亲缘关系更近。     

2株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传性分析

[目的]探讨2株H9N2分离毒株与其他参考毒株的全基因组遗传变异关系。[方法]采用RT-PCR技术扩增了2株H9N2亚型禽流感病毒分离株8个基因片段的全基因序列,并对所得序列与6个参考毒株进行了同源性比较及遗传进化树分析。[结果]2个毒株与6个参考毒株全基因组同源性在91.1%～95.4%,PG08与C/BJ/1/94的全基因序列的核苷酸同源性最高为91.3%;而ZD06与D/HK/Y280/97最高为92.3%。2个分离株的HA基因裂解位点均为PARSSR/GLF,均为H9N2低致病力禽流感病毒。[结论]ZD06株与C/Pak/2/99的亲缘关系最近,属欧亚种系;PG08株与其他毒株亲缘关系稍远,它可能是不同亚支基因重排的产物。     

中国野生柑橘上衰退病毒分离株分子特征分析

 【目的】了解中国野生柑橘上携带柑橘衰退病毒（CTV）分离株的CP/HinfⅠRFLP组群构成和分子特征。【方法】运用RT-PCR对采自中国云南、广西、四川、湖南、江西等省11个野生柑橘上CTV分离株的病毒衣壳蛋白基因(CPG)进行扩增，利用RFLP和SSCP对CPG进行分析，并将测定的CPG序列进行同源性比较和聚类分析。【结果】发现野生柑橘上11个CTV分离株以单一组群感染为主；这些CTV分离株CPG的核苷酸序列和相应的氨基酸序列同源性分别为92.5％～99.5％和95.0％～100％；与GenBank收录的9个全基因组CTV分离株的相应基因序列进行聚类分析，其核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为92.1％～98.8％和94.6％～100％。【结论】序列同源性比较说明CTV CPG具有高度保守性，同时系统进化分析表明收集到的野生CTV分离株与国外分离株分属5大类群，具有较复杂的亲缘关系。     

新疆加工番茄上番茄花叶病毒的分子鉴定

从表现花叶、畸形的加工番茄病株上获得分离物xj124,用1 对ToMV CP 基因引物进行 RT-PCR ,扩增得到了689 bp 的特异性核苷酸片段.将PCR产物插入到克隆载体pMD1 8-T中再转化到大肠杆菌TOP10.经限制酶酶切鉴定,重组克隆中含有与PCR 产物大小相同的689 bp 的插入片段.cDNA全序列分析表明,所扩增出的689 bp ToMV CP基因,含1个480 bp开放阅读框架( ORF),编码160氨基酸组成的蛋白,所克隆的基因包含完整的ToMV CP基因.所测得的xj124分离物与国内外已报道的部分ToMV CP基因序列比较,核苷酸同源性高达84.4;～99.8;,氨基酸同源性高达98.7;～100;.因此将该分离物鉴定为番茄病毒病花叶病毒.     

2株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传性分析（摘要）

[目的]了解2株H9N2分离毒株与其他参考毒株的全基因组遗传变异关系。[方法]采用RT-PCR技术扩增了2株H9N2亚型禽流感病毒分离株8个基因片段的全基因序列,并对所得序列与6个参考毒株进行了同源性比较及遗传进化树分析。[结果]2个毒株与6个参考毒株全基因组同源性在91.1%～95.4%,PG08与C/BJ/1/94的全基因序列的核苷酸同源性最高为91.3%;而ZD06与D/HK/Y280/97最高为92.3%。2个分离株的HA基因裂解位点均为PARSSR/GLF,所以均为H9N2低致病力禽流感病毒。[结论]ZD06株与C/Pak/2/99的亲缘关系最近,属欧亚种系;PG08株与其他毒株亲缘关系稍远,它可能是不同亚支基因重排的产物。