犬瘟热病毒貉、狐、貂分离株N蛋白基因的遗传多样性和功能分析

为分析从不同地区分离的犬瘟热病毒(CDV)毒株的抗原性差异,对5个CDV分离株和1个CDV弱毒疫苗株的N蛋白基因进行了核苷酸测序,并与11个参考毒株进行了比较。结果表明,5个分离株之间核苷酸序列同源性达94.5%-99.8%。China(国内疫苗株)与分离株的核苷酸序列同源性普遍较低(90.9%-93.5%)。分离株之间氨基酸序列同源性差别大(87.9%-100%),其中,HT-P与THD1的氨基酸序列同源性为100%;而与China疫苗株氨基酸同源性普遍较低,为89.7%-91.8%。China疫苗株与Onderstepoort有着很高的同源性,同源性比例分别为97.1%。分析结果显示,最近CDV的流行和免疫失败现象发生,与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关。     

貂、狐、貉源犬瘟热病毒分离株H和N基因的遗传多样性分析

为研究鼬科动物犬瘟热病毒(CDV)毒株的变异特性,对来自不同地区的貉、狐、貂的5个CDV分离株(其中HD-m、LN-m为貂源,HTp-r、THD1-r为貉源,HB-f为狐源)和1个CDV国内弱毒疫苗株(vCh)的N基因和部分H基因进行了核苷酸测序,并构建系统发生树.结果表明,5个分离株之间H基因核苷酸序列同源性均达到97.5%以上,而N基因为94.5%～99.8%.vCh与5个分离株的H基因和N基因核苷酸序列同源性普遍较低(H基因:90.5%～91.8%;N基因:90.9%～93.5%),而与国外疫苗株vCon和vOnder的H基因核苷酸同源性达96.8%和97.2%.分离株之间H蛋白氨基酸同源性差别不大(97.1%～100%),而N蛋白氨基酸同源性差别较大(91.6%～100%).5个CDV分离株与vCh疫苗株H蛋白和N蛋白同源性均普遍较低,H蛋白为89.7%～91.8%,N蛋白为92.8%～96.8%.vCh与vOnder、vCon有很高的同源性,其H蛋白氨基酸同源性分别为97.1%和95.6%,vCh与vOnder N蛋白氨基酸同源性达97.3%.结果显示,最近犬瘟热的流行和免疫失败现象的发生与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关.     

貂、狐、貉源犬瘟热病毒分离株H和N基因的遗传多样性分析

为研究鼬科动物犬瘟热病毒(CDV)毒株的变异特性,对来自不同地区的貉、狐、貂的5个CDV分离株(其中HD-m、LN-m为貂源,HTp-r、THD1-r为貉源,HB-f为狐源)和1个CDV国内弱毒疫苗株(vCh)的N基因和部分H基因进行了核苷酸测序,并构建系统发生树.结果表明,5个分离株之间H基因核苷酸序列同源性均达到97.5%以上,而N基因为94.5%～99.8%.vCh与5个分离株的H基因和N基因核苷酸序列同源性普遍较低(H基因:90.5%～91.8%;N基因:90.9%～93.5%),而与国外疫苗株vCon和vOnder的H基因核苷酸同源性达96.8%和97.2%.分离株之间H蛋白氨基酸同源性差别不大(97.1%～100%),而N蛋白氨基酸同源性差别较大(91.6%～100%).5个CDV分离株与vCh疫苗株H蛋白和N蛋白同源性均普遍较低,H蛋白为89.7%～91.8%,N蛋白为92.8%～96.8%.vCh与vOnder、vCon有很高的同源性,其H蛋白氨基酸同源性分别为97.1%和95.6%,vCh与vOnder N蛋白氨基酸同源性达97.3%.结果显示,最近犬瘟热的流行和免疫失败现象的发生与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关.     

犬瘟热病毒水貂分离株H基因的遗传多样性分析

以犬瘟热病毒水貂分离株的RNA为模板,对分离株的H基因进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后与pMD-18T Sim-pie Vector连接,成功地构建了克隆质粒pMD-18T-CDVH.序列分析表明,分离株H基因由1 596 bp组成,编码532个氨基酸,含有5个潜在的N-联糖基化位点,12个半胱氨酸残基.与已发表的24株CDV毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性在90.7%～98.6%之间:推导的氨基酸序列同源性在89.9%～97.O%之间.与Onderstepoort、Convac、Hamatsu,A75/17、TN株相比,根据推导的氨基酸序列比较分析表明,N-联糖基化位点的数目与位置均存在差别.聚类分析结果表明分离株与Snyder Hill毒株的亲缘关系最近,二者与疫苗株Onderstepoort和Convac具有较高的同源性,组成一组,而与标准野毒强毒株Hamatsu的亲缘关系较远. 个半胱氨酸残基.与已发表的24株CDV毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性在90.7%～98.6%之间:推导的氨基酸序列同源性在89.9%～97.0%之间.与Onderstepoort、Convac、Hamatsu,A 5/17、TN株相比,根据推导的氨基酸序列比较分析表明,N-联糖基化位点的数目与位置均存在差别.聚类分析结果表明分离株与Snyder Hill毒株的亲缘关系最近,二者与疫苗株Onderstepoort和Convac具有较高的     

犬瘟热疫苗株CDV3核蛋白基因全序列测序及分析

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒(CDV)核蛋白(N)蛋白基因序列,设计合成了1对寡聚核苷酸引物,提取犬瘟热病毒疫苗株CDV3的RNA为模板,采用RT-PCR扩增病毒的N蛋白基因,并进行产物克隆和序列分析。将CDV3疫苗株N基因与GenBank数据库中的疫苗株Onderstepoort及中国、美国和德国等分离的疫苗株或毒株共14株CDV N基因序列进行同源性分析,发现CDV3 N基因序列与疫苗株Onderstepoort的同源性为97.1%,与其他分离毒株的核苷酸同源性为92.8%～94.0%,其中与中国分离的TN株同源性为93.6%;然而,CDV3 N蛋白与它们的氨基酸同源性却基本都为96.6%～97.3%。这说明虽然犬瘟热弱毒株CDV3在核苷酸水平上与其他疫苗株毒株的差异较大,但是在氨基酸水平上的比较差异较小。     

黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因克隆及序列分析

对临床上流行的犬瘟热病毒CDV(ZH-10株)的H基因进行克隆和序列分析。结果显示:H基因全长约为1824bp;CDV ZH-10株与国外的Convac和Onderstepoort疫苗株亲缘关系较远,核苷酸同源性分别为91.3%、91.4%;ZH-10株与国内近期大部分分离株属于野毒株谱系,在基因型上归属Asia-1型。研究揭示了CDV基因型的地域性差异是近年来我国CD流行的一个主要原因,为将来研制出更加有效的CD疫苗奠定了基础。     

犬瘟热病毒H基因的序列分析

【目的】探索犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因的遗传变异情况,为CDV的防控提供理论依据。【方法】收集2014-2015年流行于上海和安徽两地的CDV野毒株,用RT-PCR方法克隆其血球凝集素蛋白基因(H),从分子水平上讨论CDV H基因的流行规律、遗传进化特性和变异情况。【结果】分离的5株CDV之间H基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.5%~99.9%和97.5%~99.2%,其与CDV疫苗株CDV3和Onderstepoort H基因核苷酸的同源性为90.9%~99.9%,氨基酸的同源性为90.4%~99.6%。进化树分析结果表明,分离到的5株CDV野毒株均属于亚洲Ⅰ型,与大部分的亚洲Ⅰ型处于同一分支。CDV H基因有9处潜在的天冬氨酸糖基化位点;H基因整体的同义突变概率与非同义突变概率的比例,即ds/dn=5.887 0。【结论】选择压力并未作用于分离到的CDV毒株,而是在中性选择作用下进化的。     

犬瘟热病毒甘肃株的分离和N蛋白基因遗传进化分析

采用Vero细胞从甘肃2008-2009年疑似犬瘟热感染病犬体内分离到8株病毒,通过RT-PCR方法扩增M蛋白基因初步鉴定所获得毒株均为犬瘟热病毒(CDV)。进一步通过RT-PCR方法扩增分离株的N蛋白基因,并进行序列分析。结果表明,8株分离株均为CDV,它们之间N蛋白基因的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为98.4%~99.7%、98.3%~99.6%;8株CDV分离株的N蛋白基因和TN、A75/17相应序列的核苷酸同源性分别为98.5%~99.5%、97.0%~98.0%,推定的氨基酸同源性分别为98.3%~99.2%、98.7%~99.8%;8株CDV分离株N蛋白基因和疫苗株(Onderstepoort和Snyder Hill)的相应序列的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为93.0%~94.0%、96.8%~98.3%。根据N蛋白基因所建立的遗传系统发育树可知这8株CDV分离株与TN的亲缘关系较近,而与疫苗株处于不同的分支上。说明从甘肃分离的CDV野毒株和TN由同一毒株演化而来,与疫苗株亲缘关系较远。     

狐、貉源犬瘟热病毒H和F基因的克隆与序列分析

为研究我国圈养狐、貉流行犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)的基因分型与遗传变异情况,通过RT - PCR方法扩增与测序分析了2009年来源于山东省和河北省病料中的CDVH与F基因,并分别与GenBank CDV野毒株和疫苗株的基因序列比对,构建了核苷酸序列的系统发生树.H基因系统发生分析显示,6株毒株归属为Asia -1型.H蛋白氨基酸序列比较表明,除HeB(09)3株有8个潜在N-连接的糖基化位点外,其余毒株N-连接的糖基化位点均为9个.以往的研究结果显示,日本和中国台湾分离株的潜在N-连接糖基化位点为8～9个.6株野毒F蛋白编码区氨基酸的同源性为98.0％～99.5％,与CDV3(登录号EU726268)和Onderstepoort(登录号AF305419)疫苗株的同源性为89.1％～90.6％,F蛋白的前导区(1～ 135位氨基酸)与疫苗株相比的同源性为62.2％～66.7％;野毒株F蛋白氨基酸在108～ 110处比疫苗株CDV3多1个潜在N-连接的糖基化位点,HeB(09)3的F蛋白还在366～369位多1个潜在的N-连接的糖基化位点.目前在山东省和河北省2地狐狸和貉中流行的犬瘟热野毒株为Asia -1型,HeB(09)3株H蛋白和F蛋白在N-连接糖基化方面与其他5株野毒株有明显的不同.     

广东地区犬瘟热病毒血凝素基因的克隆与序列分析

【目的】对广州和东莞市宠物犬感染犬瘟热病毒(CDV)的情况进行病原鉴定和分析,为监测CDV的遗传变异情况和防治犬瘟热(CD)提供数据基础。【方法】从表现CD症状的犬只中鉴定了17份CDV阳性样本,采用RT-PCR的方法克隆得到这些野毒株的血凝素(H)基因序列,采用生物信息学方法进行序列比对分析。【结果】17株CDV的H基因核苷酸与氨基酸序列的相似性分别为97.4%～100.0%和97.5%～100.0%,与Onderstepoort、Lederle和Convac等疫苗株相比,其核苷酸与氨基酸序列相似性分别为90.3%～91.5%和89.4%～90.8%。进化树分析结果显示,17株CDV野毒株均属于AsiaⅠ型,与疫苗株的分支较远;本研究鉴定的野毒株已进化形成9个潜在的N-糖基化位点。【结论】AsiaⅠ型CDV仍为该地区的流行基因型,基因型较稳定,但与疫苗株相比形成了一定的进化距离和出现了大量的变异。因此,继续监控CDV在犬群中的进化,掌握其遗传变异状况具有重要意义。     

犬瘟热病毒扬州分离株融合蛋白F和附着蛋白H基因的序列分析

根据Genbank犬瘟热病毒(CDV)毒株序列分别设计融合蛋白F和附着蛋白H全基因的2对引物,以2个CDV扬州分离株(CDV-YZ0101、CDV-YZ0102)为模板RT-PCR扩增出H基因和F基因2个片段,将其克隆进pGEM-Teasy载体,并进行序列分析.结果表明H基因的开放阅读框架(ORF)为1 824 bp,2种分离株间核苷酸和编码氨基酸同源性达98%左右,与中国长春分离株、美国、日本分离株的同源性分别为96%、93%～95%和90%～91%.氨基酸分析显示扬州分离株与其他分离株的H蛋白有8～9个可能的天冬酰胺糖基化位点,而OP-CDV疫苗株只有4个类似位点.扬州分离株与长春分离株同属一个系,与美国、日本分离毒株以及疫苗株相比,均存在着明显的差异.F基因ORF为1 989 bp,不同毒株间的核苷酸及编码氨基酸差异主要表现在信号肽区域,而编码的F0前体蛋白表现出较高同源性(97%～99%),且所有的13个半胱氨酸残基、4个可能的天冬氨酰糖基化位点和2个疏水区域均完全一致.因此CDV F与H蛋白基因相比有很高的同源性,证明中国分离株与国外参考株有差异.     

犬瘟热病毒GZ2株的分离鉴定及H基因原核表达质粒构建

对疑似CD的贵宾犬病料进行了CDV的分离和初步鉴定以及H基因的克隆和序列分析,以探讨不同分离株之间H基因的差异。结果表明:采用同步接种的方法,分离到1株犬瘟热病毒(CDV GZ2),并以其RNA为模板,扩增克隆了该病毒血凝素(H)基因,进而构建原核表达质粒pET-H。该毒株H基因ORF大小为1 824bp,可编码607个氨基酸;与国内分离株氨基酸一致性为97.4%～98.5%,与国外分离株为89.6%～95.6%,与疫苗株在89.6%～91.6%。进化分析表明:CDV的分布具有一定地域性,CDV GZ2与国内东北地区分离株亲缘关系近,而与国外分离株亲缘关系相对较远。     

犬瘟热病毒的分离与鉴定

[目的]分离与鉴定犬瘟热病毒(CDV)的石河子流行株。[方法]对临床症状疑似犬瘟热和血清学(ELISA)检测为阳性的自然发病犬,取其淋巴结为病料,接种于非洲绿猴肾细胞系(Vero),进行病毒的分离;用RT-PCR检测感染CDV分离株特异性核酸。[结果]病料接种Vero细胞产生明显的细胞病变(CPE),用RT-PCR技术可扩增出CDV特异性核酸,扩增出的基因片段与预期设计的长度相同,所扩增的CDV分离株H基因片段与CDV C54标准强毒株核苷酸同源性为98.4%。[结论]该研究成功分离并鉴定了CDV石河子流行株,为犬瘟热(CD)的确诊提供了依据。     

犬瘟热病毒H基因5＇端的表达纯化及抗原性分析

为了获得高纯度的犬瘟热病毒5＇端H蛋白,本研究通过参考GenBank中发表的CDVH蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从犬瘟热病毒疫苗毒株CDV3和野毒株CDVSD株提取总RNA,经FIT—PCR扩增得到388bp的基因片段,将目的基因与原核表达载体pET28a（＋）连接构建了pET28a—CDV3-H5和pET28a—CDVSD-H5重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。重组表达载体pET28a—CDVSD—H5在大肠杆菌中成功的表达,目的重组蛋白为22kD,而pET28a—CDV3-H5未能表达。经Ni—NTA洗脱纯化后,rCDVSD—H5蛋白被成功纯化。Western blot分析表叫,表达产物能够被犬抗CDV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。为血清学诊断方法的建立和基因工程疫苗的研究奠定基础。     

犬瘟热病毒小熊猫株核蛋白和融合蛋白基因克隆及序列分析

根据GenBank中报道的CDV核苷酸序列,设计合成了2对特异性引物,对犬瘟热病毒小熊猫株(CDVLP)核蛋白(N)和融合蛋白(F)两种主要结构蛋白基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明,CDVLP株N蛋白基因全长1571bp,预测编码523个氨基酸;F蛋白基因全长1989bp,预测编码662个氨基酸,F蛋白氨基酸序列中含有5个潜在的N-联糖基化位点。聚类分析提示,CDVLP株是一株与CDV强毒株亲源关系很近的毒株。用DNAstar软件对CDVLP株和Onderstepoort弱毒株N蛋白和F蛋白进行了疏水性及抗原表位预测分析。抗原表位差异提示CDVLP毒株N和F蛋白的免疫原性可能要优于Onderstepoort弱毒株。在分子水平上阐明了CDVLP株的N和F蛋白基因更适合作为构建基因疫苗和重组活载体疫苗的目的基因。     

狐貉源犬瘟热病毒核蛋白基因的克隆及序列比较分析

参照已发表的犬瘟热病毒(CDV)核蛋白基因(N)序列设计合成了1对引物,用RT-PCR方法对从发病狐、貉中分离的MS01、SC01、ZD01三株CDV的N基因进行扩增,并分别将其PCR产物进行克隆和测序。测序结果表明:3病毒分离株N基因阅读框架全长均为1572bp,编码523个氨基酸。利用DNAstar的MegAlign生物软件,将3病毒分离株与Genbank数据库中现有的CDV毒株的N基因序列及推导出的氨基酸序列进行了同源性比较和系统进化树分析,结果发现:3病毒分离株与强毒参考株A75/17等野毒株高度同源,核苷酸同源为96.2%～99.1%,氨基酸同源为96.0%～99.8%,而与疫苗株Onderstepoor相对较远,核苷酸同源为93.6%～94.0%。N基因的系统进化关系分析显示:3病毒分离株均归为强毒株,并且与中国新疆的TN株、中国台湾的Kaohsiung株基因型最近,表现出一定的地理位置相关性。     

大熊猫源犬瘟热病毒基因组遗传特征分析

【目的】对首次暴发的大熊猫源性犬瘟热病毒（panda derived-canine distemper virus,P-CDV）全基因组进行克隆测序,以了解大熊猫源CDV的全基因组遗传变异情况,进一步追踪感染源,为大熊猫犬瘟热防控提供理论依据。【方法】根据GenBank公布的CDV全基因组序列设计17对特异性引物,利用RT-PCR技术,从感染犬瘟热病毒的大熊猫肺渗出液中分片段扩增CDV全基因序列,并克隆到pMD19-T载体中;经测序、拼接,获得第一个P-CDV全长cDNA序列;利用DNAman生物学分析软件分别对全基因组序列、H蛋白基因序列、F蛋白基因序列、P蛋白基因序列、M蛋白基因序列等进行遗传变异分析,构建系统进化树。【结果】经序列测序和拼接,大熊猫源犬瘟热病毒全基因组长15 690 nt,GenBank登录号为KP677502,主要编码6种蛋白,分别是N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、H蛋白和L蛋白,在各个基因及间隔区中未发现碱基插入和缺失。遗传进化分析显示,P-CDV全基因组与20株代表性CDV全基因组序列同源性为91.5%-98.7%,P-CDV与强毒株MKY-KM08（HM852904）、PS、HLJ1-06（JX681125）、Hebei（KC427278）以及AC96I-H358（AB753776）在一个大的分支上,与PS株（JN896331）亲缘关系最近,同源性为98.7%,与标准野毒株Strain A75-17（AF164967）同源性为95.7%,与疫苗株CDV3（EU726268）亲缘关系较远,同源性为91.5%。H蛋白氨基酸序列分析和系统进化树表明,大熊猫源犬瘟热病毒属于强毒株,基因型为Asia-I型。P-CDV各蛋白基因与20株代表性的毒株相比有9处氨基酸发生了变异,与GenBank上现有的CDV序列相比,其中3处是独有的,分别是：F蛋白基因的208位由N（Asn,天冬酰胺,强毒株多为N）或K（Lys,赖氨酸,弱毒株多为K）变成了S（Ser,丝氨酸）,第215位由S变成了A（Ala,丙氨酸）,P蛋白基因的58位由Q（Gln,谷氨酰胺）变成K（Lys,赖氨酸）。【结论】成功克隆了大熊猫源犬瘟热病毒的全基因,并完成了序列分析,发现了在F、P基因上碱基的重要变异。这些数据将为研究大熊猫犬瘟热的遗传变异和流行特征提供分子生物学依据。