规模化养殖场猪伪狂犬病的诊断

正猪伪狂犬病常引起妊娠母猪流产、产死胎、木乃伊胎以及新生仔猪的呼吸道损伤和神经症状。仔猪的发病率最高可达100%,给我国养猪业造成了巨大的损失。1发病情况及临床症状天津某猪场有基础母猪600头,2014年1月份开始出现流产,在20天的时间里有48头母猪出现流产或产死胎。此外,还有3头母猪早产(107天),母猪体温38.3℃~38.7℃,没有其他异常表现。新生仔猪有少数出现拉稀、侧卧、四肢划动、吐白沫等症状,2~3天内死亡。对发病仔猪剖检发现肺有严重的出血性坏死,脾、肾也有瘀血和坏死。     

牛γ干扰素在CHO细胞中的表达和鉴定

为获得高活性的牛γ干扰素(BoIFN-γ),依据GenBank中已发表的BoIFN-γ基因序列(M29867)进行人工合成,应用PCR方法扩增该基因,将其插入pIRESneo构建真核表达质粒,转染到CHO细胞中,用SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达,并用牛γ干扰素检测试剂盒鉴定其反应原性.结果:成功的构建了pIRES-BoIFN-γ真核表达载体,实现了其在CHO细胞上的表达.表达产物经γ-干扰素检测试剂盒检测具有良好的反应原性,为研究BoIFN-γ结构与生物学功能以及建立牛结核BoIFN-γ检测法奠定了基础.     

规模猪场猪伪狂犬病的诊断实例

天津某规模猪场发生妊娠母猪流产、产死胎及部分仔猪发病的情况,为确诊病原,分别对流产胎儿的组织和母猪血清进行了实验室检测。流产胎儿的组织经PCR或RT-PCR检测,猪伪狂犬病毒(PRV)为阳性,猪圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为阴性。经猪伪狂犬病毒野毒株实时荧光PCR检测胎儿组织为阳性,检测母猪血清中猪伪狂犬gE抗体为阳性;用病毒的分离培养试验分离到了猪伪狂犬病毒,根据临床症状、抗原抗体检测及病毒的分离培养试验确诊该猪场存在猪伪狂犬病毒野毒感染。     

犬病毒病分子生物学诊断技术与临床应用

一、PCR技术聚合酶链反应(Poly-merase Chain Reaction,PCR)是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。目前已广泛应用到分子生物学研究的各个领域,在犬病毒病诊断中也得到广泛应用。(一)基本原理     

北京地区猪圆环病毒3型感染的检测及基因组遗传变异分析

旨在了解北京地区猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的流行现状、分子生物学特征和遗传变异规律,为PCV3的防控提供参考依据。采集北京地区规模化养殖场73份临床表现为繁殖障碍和呼吸系统疾病的组织样品,对其中的PCV3进行检测和测序。根据PCV3全基因组序列设计3对特异性引物,从患PDNS的断奶仔猪内脏组织中扩增PCV3全基因序列片段,克隆到pMD19-T载体中,经测序、拼接获得PCV3全长cDNA序列,利用DNAStar和DNAMAN生物软件对全基因组进行遗传变异分析。结果:北京地区PCV3感染率为30.1%(22/73),PCV3全基因组长2 000bp,GenBank序列登录号为MG546667,将该病毒命名为PCV3/CN/BJ-YH2016。其基因组有3个开放阅读框(ORF),其中两个ORF编码的蛋白与圆环病毒的复制相关蛋白(replication-associated protein,Rep)和衣壳蛋白(capsid protein,Cap)同源。PCV3/CN/BJ-YH2016与NCBI上30株PCV3基因组序列相似性为98.6%~99.3%,Rep蛋白氨基酸序列与美国毒株PCV3-US/MO2015(KX778720)的相似性最高(为100%),与中国毒株PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016(MF589105)相似性最低(为95%),有16个氨基酸变异,全部集中在5-23位氨基酸。Cap蛋白氨基酸序列与美国毒株2164(KX458235)的相似性为100%,与其他毒株均有1~4个氨基酸发生变异,其中与PCV3-US/MO2015毒株相比变异位点分别位于24、26、56、100aa。以上试验结果表明,成功从患断奶仔猪多系统衰竭综合征仔猪体内克隆了PCV3全基因,并完成了序列分析,这些数据将为研究这种新型病毒——PCV3的遗传变异和流行病学特征提供分子生物学依据。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

2006年6月份以来,我国多个省份暴发高致病性猪繁殖与呼吸综合征,给我国养猪业造成了巨大经济损失.为全面了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在我国的流行情况以及遗传变异规律,本研究采用RT-PCR的方法,对从2006年8月至2007年10月期间,来自于19省(市)共474份样品进行高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸的检测,结果检出阳性样品294份.在各省不同时期样品中均有阳性样品检出.通过对阳性样品进行Nsp2基因和ORF5基因扩增,序列分析发现所有检测的猪繁殖与呼吸综合征病毒株高度同源,为同一毒株遗传变异而来,所有猪繁殖与呼吸综合征毒株与HB-1株遗传关系最近;且Nsp2均缺失30个氨基酸.     

某规模化猪场伪狂犬病的诊断

河南平顶山某猪场母猪出现较严重的流产和产死胎现象,且50日龄~70日龄仔猪出现神经症状,根据临床表现初步诊断为伪狂犬病。为排除猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟,进行了实验室诊断。应用ELISA方法检测发病保育猪及母猪血清的伪狂犬病病毒野毒株gE抗体,并对发病仔猪病料进行了伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的实时荧光定量PCR检测。结果显示,伪狂犬病病毒野毒抗体阳性,实时荧光定量PCR检测确定仔猪病料中PRV核酸阳性,PRRSV和CSFV核酸阴性。结合临床症状及实验室检测,确诊该猪场发生的是猪伪狂犬病。     

大熊猫源犬瘟热病毒基因组遗传特征分析

【目的】对首次暴发的大熊猫源性犬瘟热病毒（panda derived-canine distemper virus,P-CDV）全基因组进行克隆测序,以了解大熊猫源CDV的全基因组遗传变异情况,进一步追踪感染源,为大熊猫犬瘟热防控提供理论依据。【方法】根据GenBank公布的CDV全基因组序列设计17对特异性引物,利用RT-PCR技术,从感染犬瘟热病毒的大熊猫肺渗出液中分片段扩增CDV全基因序列,并克隆到pMD19-T载体中;经测序、拼接,获得第一个P-CDV全长cDNA序列;利用DNAman生物学分析软件分别对全基因组序列、H蛋白基因序列、F蛋白基因序列、P蛋白基因序列、M蛋白基因序列等进行遗传变异分析,构建系统进化树。【结果】经序列测序和拼接,大熊猫源犬瘟热病毒全基因组长15 690 nt,GenBank登录号为KP677502,主要编码6种蛋白,分别是N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、H蛋白和L蛋白,在各个基因及间隔区中未发现碱基插入和缺失。遗传进化分析显示,P-CDV全基因组与20株代表性CDV全基因组序列同源性为91.5%-98.7%,P-CDV与强毒株MKY-KM08（HM852904）、PS、HLJ1-06（JX681125）、Hebei（KC427278）以及AC96I-H358（AB753776）在一个大的分支上,与PS株（JN896331）亲缘关系最近,同源性为98.7%,与标准野毒株Strain A75-17（AF164967）同源性为95.7%,与疫苗株CDV3（EU726268）亲缘关系较远,同源性为91.5%。H蛋白氨基酸序列分析和系统进化树表明,大熊猫源犬瘟热病毒属于强毒株,基因型为Asia-I型。P-CDV各蛋白基因与20株代表性的毒株相比有9处氨基酸发生了变异,与GenBank上现有的CDV序列相比,其中3处是独有的,分别是：F蛋白基因的208位由N（Asn,天冬酰胺,强毒株多为N）或K（Lys,赖氨酸,弱毒株多为K）变成了S（Ser,丝氨酸）,第215位由S变成了A（Ala,丙氨酸）,P蛋白基因的58位由Q（Gln,谷氨酰胺）变成K（Lys,赖氨酸）。【结论】成功克隆了大熊猫源犬瘟热病毒的全基因,并完成了序列分析,发现了在F、P基因上碱基的重要变异。这些数据将为研究大熊猫犬瘟热的遗传变异和流行特征提供分子生物学依据。     

禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法的建立

为建立一种简便、快速、灵敏、准确的禽流感病毒N9亚型检测方法,根据GenBank中收录的禽流感病毒N9亚型高度保守的基因序列设计引物,通过优化反应条件建立禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法,并对该方法进行灵敏度、敏感性、特异性试验和临床样品检测。建立了禽流感病毒N9亚型RTPCR检测方法,用该方法检测时,H7N9、H10N9均呈阳性,而非N9亚型的禽流感病毒及新城疫病毒等其他禽传染病病毒均呈阴性,能检测到1/32血凝单位的H7N9禽流感病毒。建立了禽流感病毒N9亚型RTPCR检测方法,具有操作简便、灵敏度高、特异性强的特点,值得推广应用。     

PTEN 基因在犬乳腺肿瘤组织中的表达及临床意义

有关酪氨酸磷酸酶基因（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen,PTEN）在乳腺肿瘤中的检测在人医早有报道。为了研究PTEN基因在犬乳腺肿瘤组织中的表达情况,笔者运用实时荧光PCR定量检测了38例不同的犬乳腺肿瘤组织（包括15例良性乳腺肿瘤和23例恶性乳腺肿瘤）、4例正常犬乳腺组织。结果发现：PTEN基因在犬恶性乳腺肿瘤组织中表达量明显低于其在良性乳腺肿瘤和正常乳腺组织中的表达量,两者差异极显著（P〈0.001）;PTEN在良性乳腺肿瘤组织中的表达与正常犬乳腺组织相比,差异不显著（P〉0.05）;发生了淋巴结转移的乳腺癌PTEN基因的表达量与未发生转移的乳腺癌组织的表达量间差异亦不显著（P〉0.05）,且PTEN的表达量与肿瘤组织的大小和发病动物年龄无关。结论：PTEN蛋白表达异常可能与乳腺肿瘤发生、发展相关,可考虑作为判断犬乳腺肿瘤生物学行为和预测的指标。