IBDV细胞适应株的驯化及其VP2基因的分子特征分析

【目的】对从河南某地区发病鸡群中分离出的1株IBDV进行驯化使适应永生细胞DF-1,并对其VP2基因进行克隆和生物信息学分析,对IBDV分离株及其细胞适应株的VP2高变区及七肽区进行比较。【方法】测定IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50);通过SPF鸡胚-CEF-DF-1途径对X1进行驯化,使其适应永生细胞DF-1;根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV分离株和细胞适应株的VP2基因并测序,将其与参考毒株进行同源性和进化树分析,同时对二者在VP2高变区及七肽区的推导氨基酸序列进行对比分析。【结果】IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的ELD_(50)为10-8 mL~(-1),经驯化获得了细胞适应株C1。对2株病毒的VP2基因进行克隆并鉴定,测序分析得IBDV X1株在第222,256,294和299位上具有A、I、I、S4个特征性氨基酸,与IBDV超强毒株(vvIBDV)HK46 VP2基因氨基酸序列的同源性高达99.3%,确定X1株为IBDV超强毒株。同源性及进化树分析结果显示,C1株与IBDV减毒株CEF94亲缘关系较近,同源性较高,为99.6%,确定C1株为IBDV减毒株。在VP2高变区及七肽区推导氨基酸比对中显示,C1株第330位精氨酸R取代了X1株在330位的丝氨酸S;第222位氨基酸由A变成P;决定病毒毒力的位点第256和284位分别由I、A变为V和T。【结论】成功驯化了1株vvIBDV使其适应细胞,初步揭示vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化的过程中,VP2高变区及七肽区氨基酸序列有明显变化。     

3株鸽源新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

对3株鸽源性新城疫病毒F基因进行扩增和序列分析,探讨分离毒株相互之间以及与疫苗毒之间的遗传进化关系.采集病料,通过非免疫鸡胚接毒传代分离病毒,HA及HI试验鉴定其为ND病毒;设计特异性引物,RT-PCR扩增分离ND病毒F 基因的重要功能区片段(1 395 bp),并对其进行克隆、测序及序列分析.结果表明:3株鸽源NDV陕西分离株相互之间F 基因核苷酸序列的同源性在98.0%～99.3%,氨基酸序列同源性为98.5%～99.1%;其F 基因裂解位点的氨基酸组成与NDV 强毒株的特征性结构(112 R-R-Q-K-R-F117 )一致.系统发育进化树表明,此3 株强毒株与某贵州分离株(登录号:EF589137) 高度同源,处于进化树的同一分支,属于基因Ⅵ型.分离到的3株鸽源NDV之间同源性较高,鸡胚病变和序列分析表明其为强毒,与传统的La Sota,B1等疫苗株同源性很低.     

新城疫病毒的分离与鉴定

[目的]对活禽市场进行新城疫病毒的流行病学调查.[方法]从活禽市场采集40份鸡泄殖腔棉拭子,由SPF鸡胚扩增病毒,收集病毒尿囊液;采用RT-PCR技术扩增新城疫病毒的DNA,并测序.[结果]共分离出4株新城疫病毒.通过对分离株F蛋白的氨基酸序列分析发现,分离株裂解位点附近的氨基酸残基组成均为112ERQERL117,符合新城疫病毒弱毒株裂解序列特征,而且分离到的NDV之间具有较高的同源性,介于86.3％ ～ 93.9％,并与疫苗株LaSota的F基因核苷酸序列属于同一分支.[结论]小型活禽市场中鸡携带了弱毒新城疫病毒,因此应加强活禽市场的管理.     

广西马流感病毒(A/Equine/Guangxi/1/09)NA基因的克隆与序列分析

[目的]了解广西马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的分子流行病学特征并揭示其遗传变化规律,为其疫苗候选毒株的筛选及有效防控马流感疫情奠定基础.[方法]采用RT-PCR对广西EIV分离株(A/Equine/Guangxi/1/09,简称GX09株)进行NA基因扩增,经克隆测序及序列比对分析,绘制遗传进化树.[结果]GX09株NA基因全长1420 bp,其开放阅读框(ORF)为1413 bp,编码470个氨基酸,包含7个糖基化位点及17个半胱氨酸(Cys)残基.GX09株与参考毒株的NA基因核苷酸同源性为74.7％～99.5％,其推导氨基酸同源性为80.4％～99.4％;与Gansu08株、Heilongjiang08株、Inner mongolia08株及Liaoning08株的核苷酸及其推导氨基酸同源性最高,分别为99.5％和99.4％;与1989年在我国吉林分离获得毒株(Jilin89)的同源性最低,对应的核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为74.7％和80.4％.从遗传进化树可以看出,GX09株与最近几年国内外分离获得的毒株亲缘关系较近,且同属于美洲型分支.[结论]目前广西流行的EIV与国内外的流行毒株一致.     

11株H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因遗传分析

[目的]本文旨在了解H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传特点和变异情况。[方法]选择2008—2013年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的11株H9N2亚型禽流感病毒,用RT-PCR方法对NA基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性及遗传进化分析。[结果]11株毒株的NA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为86.2%~99.5%和86.9%~99.1%,均属于欧亚分支。其中9株鸡源毒株属于Y280-like亚系,在NA蛋白颈部63~65位点缺失了3个氨基酸;2株鸭源毒株属于G1-like亚系,在颈部39~40位点缺失了2个氨基酸。11株分离株除了69、146、200、234位点处潜在的N-糖基化位点比较保守以外,其余的糖基化位点都出现了变异情况。红细胞结合位点(HB)在431~433位点区域比较保守,但在366~373和399~404位点区域的氨基酸发生了明显的变异。抗原决定簇中部分氨基酸序列变异也较为活跃,推测与使用疫苗后的抗体选择有关。NA蛋白酶活性位点处的氨基酸非常保守,没有发生与抗神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变。[结论]江苏、安徽、浙江等省养殖鸡群中的H9N2亚型禽流感病毒仍以Y280-like分支较为常见,鸭群中出现G1-like分支应引起人们的注意。NA基因存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。     

鸡新城疫病毒分离株F基因的分子特性分析

【目的】对新城疫病毒(NDV)分离毒株进行分子特征分析,了解免疫鸡群发生新城疫的原因。【方法】用非免疫鸡胚从病鸡肺脏中分离新城疫病毒;参考GenBank上发表的NDV的F基因序列设计引物,应用RT-PCR方法对新城疫病毒分离株进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行F基因核苷酸及推导氨基酸序列分析。【结果】从发病鸡群中分离到6株NDV,分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%;分离毒株与参考毒株的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%;分离毒株F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;6个分离株均属NDV基因Ⅶ型。【结论】NDV分离株的F基因已经发生明显变异,与La Sota、Clone-30、V4等常用疫苗株在遗传进化上的亲缘关系较远,这可能是免疫鸡群发生新城疫的重要原因之一。     

鸡传染性法氏囊病毒BJ 10株分离鉴定及其VP2基因序列分析

分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV),并对其VP2基因进行序列分析。从陕西宝鸡地区疑似疫情的鸡群分离到1株IBDV（命名为BJ 10株）,应用血清学琼脂凝胶免疫扩散试验(agar gel immunodiffusion test, AGID),结果在抗原孔和血清孔间可见明显的白色沉淀线。通过RT PCR扩增VP2基因高变区并对其进行生物信息学分析,结果表明,BJ 10株与超强毒株中国香港HK46的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.7%和 99.6%,且高变区特征性氨基酸的变化与超强毒株完全一致,表明BJ 10株属于超强毒株,与香港地区的vvIBDV分离株有较为密切的亲缘关系。     

H1N1猪流感病毒广西分离株HA基因序列分析

【目的】了解H1N1猪流感病毒广西分离株的分子特征,为广西猪流感疫情监控提供参考依据。【方法】采用RT-PCR对2011年分离获得的H1N1猪流感病毒广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）的HA基因进行扩增,然后利用DNASTAR分析软件对测序基因片段进行整个阅读框架的核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性比对分析,并用MEGA4.0绘制遗传进化树。【结果】广西分离株HA基因长1701bp,编码566个氨基酸,核苷酸序列与经典SIV的同源性为88.0%~99.6%,与季节性H1N1人流感病毒的同源性为76.3%~77.3%,与欧洲类禽SIV分离株的同源性为72.9%~75.4%,与2009甲型H1N1流感病毒的同源性为99.2%~99.6%;从核苷酸遗传进化树可知,广西分离株与类禽H1N1流感病毒和人H1N1流感病毒分离株的亲缘关系较远,而与2009甲型H1N1流感病毒分离株的亲缘关系最近。广西分离毒株HA基因的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,两个位于HA2区;广西分离株HA蛋白RBS位点的氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。【结论】广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）属于2009甲型H1N1流感病毒。     

犬瘟热病毒貉、狐、貂分离株N蛋白基因的遗传多样性和功能分析

为分析从不同地区分离的犬瘟热病毒(CDV)毒株的抗原性差异,对5个CDV分离株和1个CDV弱毒疫苗株的N蛋白基因进行了核苷酸测序,并与11个参考毒株进行了比较。结果表明,5个分离株之间核苷酸序列同源性达94.5%-99.8%。China(国内疫苗株)与分离株的核苷酸序列同源性普遍较低(90.9%-93.5%)。分离株之间氨基酸序列同源性差别大(87.9%-100%),其中,HT-P与THD1的氨基酸序列同源性为100%;而与China疫苗株氨基酸同源性普遍较低,为89.7%-91.8%。China疫苗株与Onderstepoort有着很高的同源性,同源性比例分别为97.1%。分析结果显示,最近CDV的流行和免疫失败现象发生,与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关。     

1株鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆及其分子流行病学分析

为了解河南地区鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的流行特征,研究了分离于河南新乡地区某发病鸡场的1株IBDV(XX511毒株)VP2基因的分子流行病学特征。根据Gen Bank公布的IBDV基因组序列信息,设计合成特异性引物,应用RT-PCR方法对分离于新乡某发病鸡场的IBDV野毒株XX511的VP2高变区进行克隆及分析,并将XX511毒株的VP2高变区中与毒力相关的2个亲水区及七肽区与国内外其他参考毒株进行序列比对,绘制进化树。结果显示,XX511毒株与超强毒株D49706、AJ878898的VP2基因高变区氨基酸序列的同源性均为96.8%,与广东地区JQ911703毒株具有100%的同源性。与参照的经典毒株相比,XX511毒株在第一亲水区发生了1个氨基酸位点的突变。通过与国内外(包括河南地区)其他流行毒株的比对及进化分析发现,XX511毒株与2012年广东流行JQ911703毒株处于同一分支。     

传染性法氏囊病毒安徽超强毒株的分离及分子鉴定

应用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种﹑琼脂扩散试验、电镜观察,从临床病鸡的法氏囊组织分别分离到3株传染性法氏囊病病毒(IBDV)CH03、JG04和QJ04株,对4周龄未免疫鸡的攻毒致死率分别为92%、83%、67%,对鸡胚的半数致死量(ELD50)分别为10-6.8/0.2ml、10-5.4/0.2ml、10-4.6/0.2ml;应用逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增的IBDVVP2基因高变区(vVP2)及其序列分析的结果表明,序列共有492个核苷酸,编码164个氨基酸。关键位点的氨基酸变化特征:第一亲水区P222A、疏水区的K249Q和S254G、N279D和T284A,与超强毒参考株UK661﹑HK46﹑OKYM和CH1-97极为相似,而与致弱株Cu-1)及变异毒株Var-E存在明显差异。研究结果表明,获得的3株IBDV分离株均属超强毒株。     

一株鸡传染性法氏囊病病毒基因组测序及其分子特征

[目的]测定一株鸡传染性法氏囊病病毒基因组序列及其分子特征。[方法]分离出一株具有特殊分子特征的鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）超强毒株（vvIBDV）HLJ-0504,并对其基因组进行了克隆和测序。[结果]序列分析显示,HLJ-0504的基因组A节段属于超强毒株,而其B节段则来源于另外一个独特的祖先。动物实验表明,HLJ-0504对SPF雏鸡的致病率和致死率分别为100%和86.7%。[结论]具有独特基因组B节段的vvIBDV仍在我国流行,我国IBDV的进化特征存在多样性。IBDV的毒力不是由基因组的A或B单独决定的。     

鸡传染性法氏囊病毒河南Xin-1株VP2基因的克隆与鉴定

应用反转录(RT-PCR)技术从河南传染性法式囊发病鸡中总RNA克隆出1461bp的VP2基因,并将其克隆于pGEM-T载体,筛选并构建了pT-VP2克隆载体。序列分析表明,该VP2基因及推导氨基酸序列与日本和欧洲超强毒株序列有较高的同源性,特征性氨基酸变异相似,进化分析也表明Xin-1毒株与欧洲超强毒株UK661和日本超强毒株OKYM位于同一进化分支,提示Xin-1株病毒可能为超强毒株。     

鸡传染性法氏囊病病毒河南分离株HeYD VP2基因高变区基因克隆及序列分析

为初步确定新分离的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)河南株HeYD的毒力,根据GenBank数据库中已报道的IBDV基因组序列,设计合成了1对VP2基因高变区特异性引物,应用RT-PCR方法对分离自河南省某发病鸡场的IBDV野毒株HeYD的VP2基因高变区进行了基因克隆及序列分析,并与其他参考毒株高变区进行了序列比对,序列...     

传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB-bp)基因组A节段全长cDNA的克隆和序列分析

采用RT-PCR技术,以传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB-bp)基因组RNA为模板,扩增并克隆了IBDVHB-bp株基因组A节段全长cDNA。结果表明:克隆的A节段全长共3142个核苷酸,包括5′、3′端非编码区(NCRs)和2个部分重叠的开放阅读框(ORF1和ORF2),与其它血清Ⅰ型毒株相比,HB-bp株在核苷酸水平上有32～146个核苷酸的差异,同源性为95 4%～98 8%;在氨基酸水平上有5～35个氨基酸的替代,同源性为96 9%～99 5%,与血清Ⅱ型毒株同源性为89 8%～90 8%。与其他超强毒株的同源性最高,具有超强毒株的特征性氨基酸,因此HB-bp株为中国的一个超强毒株。     

Pathogenic Antigenic and Molecular Characterization of the Very Virulent Strain(Gx) of Infectious Bursal Disease Virus Isolated in China

The very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) strain Gx was isolated from a poutl-try farm in Guangxi Province, China, during 1996. The mortality in the infected flock was 80% and occurred5 days after immunization with serotype I IBD vaccine. The results of antigen-capture ELISA (AC-ELISA),pathogenicity testing, cloning and sequence analysis of the VP2 gene showed that the deduced amino acid se-quence of strain Gx VP2 was the same as vvIBDV UK661, which is considered as a reference strain for Europe-an vvIBDVs. The antigenicity of the Gx strain was the same as an European vvIBDV strain 849. The EID50 of Gx virus was 10-8. 25/0. 2 ml, and the mortality was 64 % when 4 week-old SPF chickens were challenged atdosage of 2 × 103 EID50. We have demonstrated that the IBDV strain Gx isolated in China is vvlBDV according to European standards.     

2株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传性分析（摘要）

[目的]了解2株H9N2分离毒株与其他参考毒株的全基因组遗传变异关系。[方法]采用RT-PCR技术扩增了2株H9N2亚型禽流感病毒分离株8个基因片段的全基因序列,并对所得序列与6个参考毒株进行了同源性比较及遗传进化树分析。[结果]2个毒株与6个参考毒株全基因组同源性在91.1%～95.4%,PG08与C/BJ/1/94的全基因序列的核苷酸同源性最高为91.3%;而ZD06与D/HK/Y280/97最高为92.3%。2个分离株的HA基因裂解位点均为PARSSR/GLF,所以均为H9N2低致病力禽流感病毒。[结论]ZD06株与C/Pak/2/99的亲缘关系最近,属欧亚种系;PG08株与其他毒株亲缘关系稍远,它可能是不同亚支基因重排的产物。     

IBDV地方野毒株(XX株)VP2基因高变区的克隆与序列分析

参考GenBank发表的传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了1对特异扩增IBDVVP2基因高变区的引物。应用RT-PCR法,对分离于新乡地区典型发病鸡群的IBDV(XX株)进行了VP2基因高变区的克隆与序列分析,并和相关毒株进行了比较。结果表明,XX株与超强毒株UK661,OKYM高度相似,核苷酸同源性分别为98.73%,99.15%,氨基酸同源性都为100%,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

乌鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法,对分离于当地典型发病乌鸡群的IBDV(WJ株)进行了VP2基因的克隆与序列分析,并和相关毒株进行了比较。结果表明,WJ株与标准血清 型STC株的核苷酸和氨基酸的同源性只有91.39%和92.74%,而与超强毒株UK661和从当地鸡群中分离的超强毒株HN01株的核苷酸和氨基酸的同源性则较高,其中,与其核苷酸同源性分别为95.43%和95.87%,与其氨基酸同源性均为96.77%。且该毒株的VP2基因序列完全具备超强毒株的主要特征。由此说明,分离于当地发病乌鸡群的IBDV为超强毒株,并和当地流行的鸡IBD超强毒株有较高的同源性,但也有明显的差异。