鸡传染性囊病双抗体夹心Dot-ELISA诊断法的建立及应用

本研究以醋酸纤维素膜作为固相载体、辣根过氧化物酶标记鸡抗传染性囊病病毒抗体(IBD—IgG)、饱和联苯胺为底物显色建立了一种简便、快速、敏感的鸡传染性囊病双抗体夹心Dot—ELISA诊断法。经方阵实验确定最佳反应条件为:IgG的包被液为0.05MpH9.6碳酸缓冲液,包被浓度为1:50;酶标抗体的工作浓度为1:100;洗涤液为含0.05％吐温—80的0.02MpH7.4磷酸缓冲液,封闭液为含0.2％明胶的洗涤液,封闭时间,抗原及酶标抗体的作用时间均为37℃30分钟。应用本方法和琼扩试验一同检测20份已知阳性病料,120份待检病料和胚毒尿囊液、10份正常鸡样品进行对比试验,结果表明Dot—ELISA阳性率为90％,而AGP只有40％;凡AGP阳性者,Dot-ELISA匀呈强阳性,而在Dot—ELISA阳性样品中,只有44％AGP阳性,其敏感度比AGP高100倍。     

琼扩试验检测鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的研究

采用琼脂扩散(AGP)试验检测免疫鸡血清和3种不同稀释液(氯仿、8％柠檬酸钠、16％氯化钠)处理的卵黄样品，结果表明，免疫后的卵黄样品与血清样品的A(；P抗体效价一致，为1：16。氯仿样品的检出率最高，为85％，血清样品的检出率为67％，8％柠檬酸钠和16％氯化钠样品的检出率分别为47％和25％。同时，对AGP检测结果分别在点样后24h、48h和72h进行观察，结果表明，AGP结果的最佳观察时间在24～48h。检测氯仿处理卵黄抗体的AGP可以代替检测血清抗体的AGP，以避免采血造成应激，具有重要的经济意义，     

猪病毒性繁殖障碍病低密度基因芯片诊断方法的建立

应用PCR(或RT-PCR)分别扩增猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒-2型、日本乙型脑炎病毒和猪瘟病毒的一段保守序列,克隆到pMD 18-T Simple Vector构建重组质粒,用于制备各病毒的探针。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上并加以固定,制备成低密度检测基因芯片。在多重PCR扩增过程中用生物素标记的dUTP(Bio-11-dUTP)对待检样品进行标记,扩增产物与芯片杂交,用扫描仪对杂交结果进行扫描分析。经对68份样品检测结果证明,该方法可以同时检测待检样品中上述6种病毒核酸的存在情况,与PCR方法相比,显示了较高的灵敏度。该方法的建立,为大批量快速诊断、普查猪病毒性繁殖障碍疫病提供了保证。     

饲料中沙门氏菌的分离鉴定与Dot-ELISA检测

[目的]建立检测饲料中沙门氏菌的Dot-ELISA法。[方法]采用Dot-ELISA法,对随机采集自西宁市某饲料厂的100份成品饲料、85份鱼粉和50份精蛋白进行了沙门氏菌检测。通过生化试验和血清学试验对饲料样品中的细菌进行了进一步的鉴定。[结果]通过Dot-ELISA检测,成品饲料、鱼粉和精蛋白中的沙门氏菌阳性率分别为38.00%、62.35%和60.00%。Dot-ELISA法与常规分离鉴定技术的符合率为82.23%。[结论]Dot-ELISA法具有较好的特异性和敏感性,与常规分离技术具有较高的符合率,可以用于饲料中沙门氏菌的检测。     

空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法的建立

针对空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)旋转酶基因(gyrA gene)设计特异性引物和探针,将生物素和地高辛分别标记上游引物5＇端和核酸探针3 ＇端,并对反应条件进行优化,建立空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法.结果表明:该方法能特异的检测空肠弯曲杆菌基因组DNA,检测阈值为2fg,敏感性是常规PCR的10倍.对模拟泄殖腔样本进行检测,检测限为50 cfu/mL.对100份临床样品进行检测,PCR和PCR-ELISA方法阳性检出率分别为60％和69％.     

光敏生物素标记总DNA探针对大豆根瘤菌的检测

以光敏生物素标记慢生型大豆根瘤菌USDA110总DNA作为探针，与快生型大豆根瘤菌杂交，没有杂交斑点形成．而与慢生型大豆根瘤菌中的部分菌株能形成杂交斑点，表明该探针具有种和部分菌株特异性．用该探针与压碎的根瘤汁液进行DNA杂交，检测USDA110在不灭菌的盆栽土壤中的竞争结瘤能力，发现USDA110在大豆不同生育期的占瘤率为70％～90％．     

生物素标记cDNA探针检测苹果锈果类病毒

以含苹果锈果类病毒(ASSVd)全长序列的重组质粒PUC为模板DNA,加入ASSVd类病毒特异性引物,应用聚合酶链式反应技术(PCR)合成了生物素标记的cDNA探针,在斑点杂交反应中,探针最适使用浓度为1/10,探针检测感病的ASSVd类病毒的最大稀释倍数是1/100。利用制备的探针进行田间检测,结果与RT-PCR检测结果一致,阴性对照均无杂交信号出现。     

马立克氏病鸡组织中PRNP基因表达量分析

【目的】探明PRNP基因表达量与鸡马立克氏病发病之间的关系.【方法】从甘肃省康乐县某养鸡场采集马立克(MD)病鸡组织样品,通过RT-PCR检测MDV致瘤相关基因Meq和pp38以及病理组织学观察将样品分为MD肿瘤病变鸡、MD无病变鸡与健康鸡,最后通过荧光定量PCR方法分析3组中PRNP基因mRNA水平的相对表达量的差异.【结果】MD无病变鸡中PRNP基因的表达规律与健康鸡基本一致,但与MD肿瘤病变鸡完全不同;除脑外,MD病鸡组织PRNP基因的表达量均高于健康鸡,其中肿瘤病变组织PRNP基因的表达量显著高于无病变组织(P0.05),而且PRNP基因在MD病鸡肿瘤病变组织与健康鸡组织的表达差异与肿瘤病变程度有关.【结论】PRNP基因的表达量与MDV感染存在相关性,PRNP基因在MD肿瘤组织中过表达,且PRNP基因的差异表达与肿瘤病变程度有关.     

H3亚型猪流感病毒HA基因核酸探针的制备与应用

以地高辛(DIG)标记H3亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的保守片段制成核酸探针,与H3及H1亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病病毒(PRV)的DNA进行斑点杂交,检测探针的特异性.结果显示,该探针仅与H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验结果显示,探针最低能检出约6 pg/μL的H3亚型的SIV RT-PCR产物.应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出4份阳性病料,与RT-PCR检测结果一致.研究表明,建立的DIG标记的核酸探针特异性强,敏感性高,适合于对H3亚型SI的诊断和流行病学调查.     

柔嫩艾美耳球虫端粒DNA重复序列的South-ern印迹杂交分析

为进一步确定柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)端粒DNA的重复序列,为下一步端粒酶活性检测奠定基础,根据已克隆发表的E.tenella端粒DNA重复序列信息,设计了由4个端粒重复序列串联的寡聚核苷酸探针(TTTAGGG)4,并以生物素地高辛标记。将该探针与经BAL31-EcoRⅠ酶切后的E.tenella基因组DNA进行Southern印迹杂交分析。结果显示:E.tenella基因组DNA与探针杂交获得了清晰的杂交条带,随BAL31酶切时间的延长,杂交信号逐渐减弱,进一步证明了E.tenella端粒DNA重复序列为5-′TTTAGGG-3′,且此重复序列在E.tenella染色体的末端。     

用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒cDNA探针及其应用的研究

应用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒ｃＤＮＡ，制备核酸探针、经斑点杂交法和碱性磷酸酶显色后，探针同以ｃＤＮＡ为模板合成的ＰＣＲ产物及其重组子ｐＳＸＩＢＶＳ１均呈现强阳性的蓝色斑点，而与正常尿囊液、新城疫病毒和鸡败血霉形体无杂交。一个初诊为ＩＢ感染的田间病料与探针杂交阳性结果相符合。试验表明该ｃＤＮＡ探针是敏感和特异的检测方法。     

荧光原位杂交和流式细胞术结合(FISH-FCM)对肉食品中肠杆菌科细菌的快速定量检测

为建立一种新的荧光原位杂交与流式细胞术相结合(FISH-FCM)的方法,以快速鉴定肉食品中的肠杆菌科细菌,采用与肠杆菌科细菌16S rRNA保守序列互补的探针Enter1432并验证其特异性。结果表明:6种肠杆科细菌与探针Enter1432杂交率均在90%以上,而5种非肠杆菌科细菌与探针杂交率均低于1%;与SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》传统培养法相比,FISH-FCM定量检测法全程约需4~5 h,检测8份猪肉样品中肠杆菌科细菌数为1.4万~640万个/g,4份鸡肉样品中肠杆菌科细菌数为5.0万~21万个/g,检出率为100%。综上所述,研究建立的FISH-FCM法可快速检测肉品中的肠杆菌科细菌,适于食品卫生、临床实验室推广使用。     

库尔勒香梨的苹果褪绿叶斑病毒cDNA探针检测技术研究

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料,对两种植物总RNA提取方法进行了比较研究,从中筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法;并利用RT-PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针,在此基础上,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了实验研究。结果表明,当探针浓度为400ng/mL,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应6h,可获得最高灵敏度。Tween20的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测,并对库尔勒地区香梨带毒情况进行了检测。结果表明,不论幼叶、老叶、皮层及冷冻叶片均可出现杂交信号,两种提取方法提取的总RNA也都出现了杂交信号,库尔勒香梨样品有45%的带苹果褪绿叶斑病毒。     

检测新城疫抗体的Dot-ELISA方法的建立及其与HI方法的比较研究

建立了检测鸡群中新城疫病毒(New Castle disease virus,NDV)血清抗体的Dot-ELISA方法,对Dot-ELISA的最佳反应条件进行了研究,初步确定了该方法的感染保护临界值为7log2。通过对大量临床血清样本的检测,表明Dot-ELISA与血凝抑制试验(HI)相比,具有敏感、特异和稳定性好的优点。     

牛白血病免疫酶技术的研究

本文介绍用酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测牛白血病病毒(BLV)的抗体。以FLK-BLV细胞培养液制备的免疫扩散(ID)用的粗提抗原,经ConA-Sepharose 4B亲和层析,或先经乙醚处理,再经Sephadex G-150层析等方法,分别提取了gp和p抗原。用gp抗原作ELISA,对91份牛血清样品进行检测,阳性共67份,比微量免疫扩散(MID)高14％,两者的符合率为85％。用p抗原作ELISA对240份牛血清样品进行检测,阳性占162份,比MID法高12％,两者的符合率为87％。用gP抗原对33份样品和用p抗原对160份样品进行三次重复试验,它们的变异系数在10％以内的分别为100％和92.5％。ELISA抑制试验表明,p抗原和gP抗原对BLV抗体的特异性良好。     

基于重组MTFP基因蛋白的犬心丝虫抗体Dot-ELISA检测方法的建立

以建立Dot-ELISA检测犬心丝虫血清抗体的方法,用纯化的犬心丝虫MTFP基因蛋白为包被抗原,进行条件优化,筛选最佳反应条件,并进行敏感性、重复性和特异性等试验。结果表明,建立的犬心丝虫Dot-ELISA检测方法最佳抗原包被浓度为0.5μg·片-1;待检样品血清最佳稀释比例为1∶50;HRP标记兔抗犬抗体最佳稀释比例为1∶4 000;建立的Dot-ELISA方法敏感性为1∶200;批间重复试验证明,该方法具有良好的重复性,且与犬等孢球虫阳性血清和犬蛔虫阳性血清没有交叉反应;利用建立的方法对吉林省某地的62份待检血清进行检测,结果阳性率为4.8%。研究成功建立了基于重组MTFP基因蛋白的犬心丝虫Dot-ELISA检测血清抗体方法,为犬心丝虫病流行病学调查和临床诊断提供了新技术。     

库尔勒香梨的苹果茎痘病毒cDNA探针检测技术研究

 以库尔勒香梨叶片和皮层为材料 ,对 2种总RNA提取方法进行了比较研究 ,从中行筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法 ;并利用RT PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针 ,在此基础上 ,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了试验研究 ,结果表明 ,当探针浓度为 4 0 0ng·ml-1,甲酰胺浓度为 4 5 % ,4 2℃杂交反应 6h ,可获得最高灵敏度。进口硝酸纤维素膜的灵敏度最好 ,基本无背景。Tween2 0的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测 ,结果表     

4种猪群常见病毒基因芯片检测方法的建立与应用

【目的】建立猪瘟病毒(CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)及猪细小病毒(PPV)的基因芯片检测方法,为这4种病的实验室诊断和流行病学调查提供一种快速、高效的病原学诊断方法。【方法】根据GenBank中CSFV、高致病性PRRSV、PCV-2、PPV的相关基因序列,设计合成相关引物,采用PCR方法得到具有荧光标记的PCR产物,然后与含有特定检测探针的芯片进行杂交,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的灵敏性和重复性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法,对150份临床样品进行检测。【结果】建立了针对CSFV、PRRSV、PCV-2和PPV 4种病毒的基因芯片检测方法,该方法对临床150份样品的检测结果显示,CSFV阳性样品有25份,高致病性PRRSV阳性样品有45份,PCV-2阳性样品有70份,PPV的检测结果全部为阴性,其中混合感染样品有18份。【结论】建立了对CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV 4种猪群常见病毒的基因芯片检测方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

禽白血病病毒多重PCR检测法的建立及初步应用

根据GenBank中登录的禽白血病病毒A、B、J亚群的核苷酸序列设计合成了3对引物,各对引物可分别扩增出大小约为195、260、924bp的核苷酸片段;经优化建立禽白血病病毒多重PCR检测法,并进行其敏感性试验及对马立克病病毒(MDV)、火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、传染性囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和DF-1细胞基因组的特异性试验;应用该方法对1 294份临床样品进行禽白血病病毒检测,对阳性检出样品抽样进行测序鉴定.结果表明:该方法的最小检出拷贝数为103,特异性试验均为阴性,检出临床样品中的核苷酸片段与参考毒株核苷酸序列的同源性达98%以上,符合率100%,具有良好的特异性、敏感性和符合率,可为禽白血病病毒感染的临床诊断及流行病学调查研究提供有效借鉴.     

异羟基洋地黄毒甙元核酸探针对马立克氏病毒DNA的检测

应用异羟基泣地黄毒甙元标记的ＤＮＡ探针，检测了细胞培养物和鸡羽髓中提取的马立克氏病毒核酸。结果发现，异羟基洋地黄毒甙元标记的马立克氏病毒血清Ⅰ型（ＧＡ株）核酸的ＢａｍＨＩ－Ｌ片段探针，只与马立克氏病毒Ⅰ型核酸发生杂交，而不与Ⅱ型（ＳＢ－１）或Ⅲ型（ＨＶＴ）发生杂交。对３６份鸡羽髓病料提取的病毒核酸的杂交检测与琼扩试验相比较，前阳性率为９４．４％。后仅为８６．１％。由此说明，Ⅰ型病毒的核酸探针可