库尔勒香梨的苹果褪绿叶斑病毒cDNA探针检测技术研究

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料,对两种植物总RNA提取方法进行了比较研究,从中筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法;并利用RT-PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针,在此基础上,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了实验研究。结果表明,当探针浓度为400ng/mL,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应6h,可获得最高灵敏度。Tween20的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测,并对库尔勒地区香梨带毒情况进行了检测。结果表明,不论幼叶、老叶、皮层及冷冻叶片均可出现杂交信号,两种提取方法提取的总RNA也都出现了杂交信号,库尔勒香梨样品有45%的带苹果褪绿叶斑病毒。     

库尔勒香梨脉黄病毒RT-PCR检测技术研究

 以库尔勒香梨叶片和皮层为材料 ,对总RNA提取方法进行了研究 ,从中筛选出了适合库尔勒香梨总RNA的提取方法。结果表明 ,要获得良好的RT PCR扩增 ,RT体系中dNTPs浓度、互补引物、AMV、模板的浓度要分别达到 0 .1mmol·L-1、0 .2 μmol·L-1、0 .0 5U·μl-1、0 .0 1μg·μl-1以上。此外 ,使用RNasin能有效抑制RT体系中RNase对病毒RNA的降解作用 ,可使RT过程顺利进行 ;PCR体系中dNTPs浓度至少要达到 0 .1mmol·L-1,0 .2～ 0 .3mmol·L-1可以获得最佳的扩增效果 ;TaqE浓度要达到 0 .0 15U·μl-1以上 ;引物浓度适宜范围 0 .3～ 0 .7μmol·L-1;Mg2 + 要达到 1.2 6mmol·L-1以上。     

针对库尔勒香梨不同组织的总RNA提取方法

用常规方法，以香梨幼叶、茎尖、成熟叶片和皮层为材料时提取RNA。发现并非所有组织用同种方法都可得到高质量的RNA。因此，本文针对香梨不同组织部位，在众多方法中进行了改进和筛选从而得出适合库尔勒香梨不同组织的总RNA的提取方法。采用这些方法可以得到纯度高、含量高、完整性好的梨总RNA，使以后的实验顺利进行得以保障。     

不同贮藏条件对库尔勒香梨采后果实品质的影响

在不同贮藏条件下,对库尔勒香梨果实品质的测定,得出了库尔勒香梨果实的最佳贮藏参数是:贮藏温度-1￣0℃;O2浓度2%￣4%;CO2浓度0.06%￣2%;湿度90%￣95%。     

超声波辅助提取库尔勒香梨果肉和果皮中总黄酮的工艺研究

[目的]研究库尔勒香梨果肉和果皮中总黄酮的最佳提取工艺.[方法]以乙醇为溶剂,采用超声波辅助提取,紫外-可见分光光度法测定库尔勒香梨果肉和果皮中总黄酮的含量,以总黄酮含量为指标,考察提取温度、料液比、醇浓度、提取次数对库尔勒香梨果肉和果皮中总黄酮提出率的影响.对照品溶液和供试品溶液均在371 nm处有最大吸收,回归方程为A=0.055 1C-0.007 5,r=0.9998（0～16 μg/ml）.[结果]最终确定香梨果肉中总黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度75％,提取时间2h,提取温度40℃,提取次数为1次;果皮中总黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度85％,提取时间1.Oh,提取温度40℃,提取次数为3次.库尔勒香梨果肉和果皮中平均总黄酮得率分别为1.79和5.12 mg/g.[结论]通过稳定性、精密度和回收率试验检验了该方法的可靠性和重现性.     

不同CO2浓度贮藏条件对库尔勒香梨果心褐变及品质的影响

[目的]探讨库尔勒香梨采后贮藏适宜的CO2浓度,减少香梨贮藏过程中果心褐变的发生,为库尔勒香梨贮藏保鲜提供理论依据.[方法]以库尔勒香梨为试材,在低温冷库(温度-1.5 ～0℃,湿度95;)中经不同CO2浓度的贮藏,研究其对香梨果心褐变指数、果心褐变发病率、果实硬度、VC含量、叶绿素、色度角、相对电导率的影响.[结果]2.0;～2.5;和1.5; ～2.0;浓度CO2贮藏的库尔勒香梨分别于第80和100 d出现果心褐变,果心褐变发病率分别是13.1;、16.7;,其它各处理在贮藏过程中均没出现果心褐变.与对照相比,在贮藏过程中0.5; ～1.0;、1.0;～1.5;浓度CO2处理能够较好保持香梨果实的硬度、VC含量、叶绿素含量及色度角,降低香梨果实的相对电导率;而2.0; ～2.5;和1.5; ～2.0;浓度CO2处理则明显降低了香梨果实的硬度和VC含量,并显著增大了香梨果实的相对电导率.[结论]库尔勒香梨在贮藏过程中CO2浓度高于1.5;时易发生果心褐变,建议库尔勒香梨在保鲜过程中CO2浓度应控制在1.5;以下.     

苏云金芽孢杆菌cry基因芯片检测方法的研究

 建立了一种不经PCR扩增而直接应用寡核苷酸芯片从苏云金芽孢杆菌总DNA中检测cry基因的方法。对探针长度、浓度、总DNA含量、标记方法以及灵敏度等条件进行了研究。结果表明,用高浓度Klenow酶随机标记高浓度的总DNA与寡核苷酸探针(40～50mer、40μmol·L-1)杂交可用于检测Bt菌株中含有的cry基因;不同长度探针之间对杂交信号的影响存在显著性差异(P<0.01),而不同浓度的探针之间没有显著性差异。此方法的其它条件为杂交温度42℃、时间3h;检测的样品总DNA的灵敏度约为2.5μg;标记产物杂     

库尔勒香梨成熟果实石细胞含量与POD4基因表达量的相关性分析

【目的】研究成熟期库尔勒香梨粗皮果和正常果的石细胞含量与POD4基因即时表达量的相关性,为改良香梨果实品质提供分子依据。【方法】以成熟期库尔勒香梨粗皮果和正常果为试材,测定香梨果实的硬度和石细胞含量。提取香梨果肉总RNA,用qRT-PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction)方法测定POD4(peroxidase4)基因的即时表达量,分析硬度和石细胞含量与POD4基因表达的相关性。【结果】库尔勒香梨石细胞含量在0.4~0.52 g;硬度在245.22~314.71 kg/cm~2;POD4基因在成熟果实中的即时表达量在106.89~743.29。【结论】粗皮果石细胞含量是正常果的1.3倍,硬度是正常果的1.28倍,POD4基因的即时表达量是正常果的6.59倍。石细胞含量与POD4基因表达量成显著正相关(r=0.823),与果实硬度存在正相关(r=0.783),POD4基因表达量与果实硬度存在正相关(r=0.770)。POD4基因表达差异与形成两种表型库尔勒香梨果实成正相关。     

适合库尔勒香梨SCoT分析用的DNA提取方法研究

[目的]有效利用SCoT分子标记法对库尔勒香梨优良营养系中相关基因,获得高质量基因组DNA,对目前常用的3种提取植物基因组DNA的方法进行比较研究,研究最适合库尔勒香梨SCoT分析的DNA提取方法.[方法]采用改良CTAB法,改良SDS法和试剂盒法从库尔勒香梨优良营养系的叶片中提取基因组DNA.采用NANODROP 2000核酸仪检测DNA浓度和纯度,并用1.2;琼脂糖凝胶电泳检测其完整性.以3种方法提取的基因组DNA为模板分别进行SCoT-PCR.[结果]改良CTAB法提取的基因组DNA的浓度为600 ～1 600 ng/μL,A260/A280为1.8 ～2.0,A260/A230＜2.0,电泳结果显示:有一条清晰的带,有拖尾现象,点样孔发亮;改良SDS法提取的基因组DNA的浓度为600 ～ 900 ng/μL,A260/A280为1.8 ～2.0,A260/A230为1.9 ～2.2,电泳结果显示:一条清晰的带,无拖尾现象只有一个点样孔发亮;试剂盒法提取的基因组DNA的浓度为100 ～ 200 ng/μL,A260/A280为1.8 ～2.0,A260/A230为2.2 ～2.5,电泳结果显示:一条清晰的带,无拖尾,无点样孔发亮现象,蛋白、多糖、酚类物质、RNA等去除彻底;以3种方法提取的基因组DNA为模板进行SCoT-PCR,PCR产物电泳结果显示:试剂盒法提取的DNA可以扩增出7条清晰明亮的带,改良CTAB法提取的DNA只能扩增出4条清晰的带,改良SDS法提取的DNA只能扩增出2条带.[结论]比较目前常用的3种提取植物基因组DNA的方法,综合成本高低,毒性大小,步骤多少,时间长短,试剂盒法是最适合提取库尔勒香梨优良营养系叶片基因组DNA的方法.     

气调指标对库尔勒香梨果实贮藏质量的影响

[目的]探讨保持库尔勒香梨贮藏质量的气调贮藏条件。[方法]挑选大小一致、无病虫害、无机械伤的库尔勒香梨为试材,设置9个具有不同气体体积分数的气调处理（4％O2＋2％CO2、5％O2＋2％CO2、6％O2＋2％CO2、4％O2＋3％CO2、5％O2＋3％CO2、6％O2＋3％CO2、4％O2＋4％CO2、5％O2＋4％CO2、6％O2＋4％CO2）和1个对照处理（21％O2＋0％CO2）,研究-1℃条件下,各处理对库尔勒香梨果实硬度、可滴定酸、呼吸强度、果皮叶绿素含量、果实维生素C含量及果肉组织中相对电导率的影响。[结果]适当降低O2浓度可以减缓库尔勒香梨果实硬度和可滴定酸含量的下降、降低果实的呼吸强度、延缓果皮叶绿素和果实维生素C的降解、抑制果肉组织中相对电导率的上升。适宜的贮藏参数是：气体成分为5％O2＋4％CO2和4％O2＋3％CO2,贮藏温度为-1℃;相对湿度为90％～95％。[结论]适当降低O2浓度对保持库尔勒香梨的贮藏质量比较有利。