鸡传染性支气管炎病毒M41型的扩繁及在鸡胚肾细胞上的适应性研究

探明鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV）感染鸡胚肾细胞（Chicken Embry-o Kidney Cells,CEK cell）,并且实现其增殖为目的。将IBV稀释液注射到SPF鸡胚尿囊腔内,培养鸡胚扩繁,观察记录结果;并培养CEK细胞,采用100倍半数组织培养感染量的IBV进行染毒实验;应用Reed-Muench法计算半数鸡胚感染量为10-6.68/0.1 mL;用Real time PCR检测IBV在感染细胞中的含量,以确定IBV在CEKcells中已经感染且增殖成功。结果表明,接种10日龄的SPF鸡胚可以收集更多的、约8 mL的尿囊液毒;反复盲传至7代的IBV可使CEK cells产生明显的细胞病变效应;通过实时荧光定量PCR和RT-PCR检测,最终确定IBV-M41型扩繁成功并且能够在CEK细胞上繁殖,为下一步实验提供了参考。     

表达小鹅瘟病毒VP2蛋白重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性

【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病,鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据2012年国际病毒分类委员会（ICTV）的报告,DEV被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究,而近几年也有关于鸭瘟病毒（DEV）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段,本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上,构建表达小鹅瘟病毒（GPV）主要免疫原蛋白VP2的重组病毒rDEV-VP2,并研究其生物学特性,进而探讨重组病毒rDEV-VP2作为防治DEV和GPV的二联重组活载体疫苗的可能性。【方法】将密码子优化的GPV VP2基因通过常规基因克隆的方法插入转移载体pEP-BGH-end,构建含有GPV VP2表达框pCMV-VP2-BGH-pA的重组表达质粒。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,通过“Red E/T”两步重组法将GPV VP2基因表达框插入到DEV US7和US8基因之间构建了突变体克隆pDEV-VP2。利用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得重组病毒rDEV-VP2和删除Bac质粒序列的rDEV-VP2-Cre,并对重组病毒细胞体外生长曲线、蚀斑大小和VP2蛋白表达情况进行测定。将rDEV-VP2接种番鸭,在不同时间采集血清,采用间接ELISA法检测血清中GPV VP2抗体产生情况。【结果】间接免疫荧光检测和Western blotting分析表明,外源蛋白VP2在CEFs细胞成功表达。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果显示,rDEV-VP2在CEFs细胞上的增殖滴度与亲本株相比无显著差异,表明外源基因VP2的插入不影响rDEV重组病毒的增殖。动物试验结果表明,7日龄雏番鸭接种rDEV-VP2可以诱导产生针对GPV VP2的抗体,免疫后3周抗体阳性率为50%（4/8）。【结论】本实验将小鹅瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因组的US7和US8基因间构建了表达该免疫原性基因的重组鸭瘟病毒细菌人工染色体,继而在鸡胚成纤维细胞（CEFs）上拯救获得了重组病毒rDEV-VP2,病毒细胞生长特性与亲本株基本一致,且能诱导鸭体产生GPV VP2特异性的抗体。该研究为研制DEV-GPV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

抗羊口疮B2L囊膜蛋白单抗的免疫学初步研究

探究一株抗羊口疮病毒B2L囊膜蛋白单抗的特异性识别毒株的能力,为后续利用单抗建立检测病毒的ELISA诊断试剂盒打下基础。通过将分离株OV/HLJ/04接种于牛睾丸细胞,并设立对照组,每天定时记录细胞病变过程。根据细胞病变情况选择最佳的免疫荧光时间,然后开展间接免疫荧光试验,并对产生病变的牛睾丸细胞进行PCR鉴定。病毒接种实验显示,细胞由接种病毒到产生病变的时间约3 d,3 d后接种细胞逐渐产生大规模的病变,实验选择2 d作为荧光实验的最佳时间。通过免疫荧光实验及PCR鉴定结果表明,所获单抗能够识别感染病毒的细胞。     

永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系，为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因，将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中，构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1，进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒，转染原代猪视网膜色素上皮细胞，用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系（RPECs）。检测RPECs的角蛋白18和19，通过细胞计数测定其生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒（PEDV）CV77毒株、猪圆环病毒2型（PCV2）DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株接种RPECs，同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞（Vero细胞）,将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞（PK15细胞），将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞（BHK细胞），观察细胞病变效应（CPE），并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示，真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞，经G418筛选得到永生化细胞株，该细胞株表达角蛋白18和19，传代50代仍保持上皮样细胞形态，增殖活性良好，细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后，CPE明显，滴度为10^5.25TCID₅₀/mL，低于其在Vero细胞中的滴度（10^8.125 TCID₅₀/mL）。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE，病毒滴度为10^6.125TCID₅₀/mL，略高于其在PK15细胞上的滴度（10^6.0TCID₅₀/mL）。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后，CPE明显，病毒滴度为10^8.75 TCID₅₀/mL，略低于其在BHK上的滴度（10^8.875 TCID₅₀/mL）。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系，可用于猪源病毒的培养，尤其是培养PCV2可产生明显CPE，易于观察，为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。     

山羊痘病毒SYBRGreen I荧光PCR检测方法的建立

为建立山羊痘病毒（goat pox virus,GPV）的SYBR Green I荧光PCR方法,根据GPV的反向末端重复序列（Inverted Terminal Repeat,ITR）的核苷酸序列设计引物。以此引物和山羊痘皮肤痘疹提取的DNA为模板,建立并优化SYBR GreenI模式荧光PCR检测GPV的ITR基因的方法,并与普通PCR方法进行敏感性比较。结果表明,此次建立的检测GPV的SYBR Green I荧光PCR方法能检测出7×10^2拷贝数的DNA模板,此法比文献报道的普通PCR法更敏感、准确、快速。     

猪圆环病毒2型陕西株的分离鉴定

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的序列,设计2对PCR引物,对疑似PCV2感染猪的血液、肺脏和淋巴结等病料进行套式PCR扩增检测,并对PCR检测为PCV2阳性的病料进行PCV2分离与鉴定。结果显示,PCV2在PK-15细胞上生长良好,但增殖较慢且不产生细胞病变;在第12代细胞培养物中用间接免疫荧光试验(IFA)和PCR扩增反应均能检测到PCV2,且特异性很强。表明试验分离的病毒为PCV2。     

鱼类淋巴囊肿病毒感染牙鲆鳃细胞系的研究

以患病牙鲆的囊肿组织为试验材料,冰浴匀浆后采用低速离心的方法提取淋巴囊肿病毒,用粗提的病毒液感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,同时应用以抗淋巴囊肿病毒单克隆抗体为第一抗体的间接免疫荧光抗体技术检测淋巴囊肿病毒是否感染了牙鲆鳃细胞并在其中增殖.结果发现生长旺盛的单层牙鲆鳃细胞接种淋巴囊肿病毒2天后出现明显的细胞病变效应,形成空斑,应用间接免疫荧光抗体方法检测结果为抗淋巴囊肿病毒单抗与未接种淋巴囊肿病毒的牙鲆鳃细胞呈阴性反应,而接种病毒的牙鲆鳃细胞,细胞质中有明显的特异性荧光,该结果说明牙鲆鳃细胞系是淋巴囊肿病毒的敏感细胞系.     

应用半套式RT-PCR技术诊断番鸭呼肠孤病毒病

参考GenBank中番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计并合成3条引物C1、HP11和HP12,组成半套式RT-PCR,扩增片段为300 bp.应用该半套式RT-PCR对MDRV、禽呼肠孤病毒(ARV)、番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸡胚成纤维细胞(CEF)和番鸭胚成纤维细胞(MDEF)培养物进行扩增.结果仅能从MDRV中扩增出300 bp特异片段,而不能从ARV、MPV、GPV、CEF和MDEF细胞培养物中扩增出特异片段;该方法检测灵敏度为1 fg核酸,重复性好.对人工感染和临床疑似病例用病毒分离和半套式RT-PCR进行检测,2种方法符合率为100%.因此,该半套式RT-PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒病的临床快速检测.     

新型鸭呼肠孤病毒在DF-1细胞系中的增殖特性

为了研究新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)在鸡胚成纤维细胞DF-1中的增殖特性,将NDRV JDM10毒株接种到DF-1细胞,连续传代后,通过观察病毒对细胞的致病变效应,测定半数组织感染量(TCID₅₀)、RT-PCR检测、间接免疫荧光(IFA)及Western-blot免疫学检测,探索NDRV对DF-1细胞的作用效果。结果表明,NDRV JDM10毒株在DF-1细胞中能有效增殖,产生明显的致病变效应;RT-PCR检测成功扩增出1条大小为1 001 bp的条带;病毒蛋白在细胞中获得了良好的表达,并与抗NDRV σC单克隆抗体发生特异性反应;NDRV JDM10毒株在感染DF-1细胞后会经历潜伏期、快速增长期、稳定期3个时期,并在72 h病毒效价达到峰值,TCID₅₀为1×10^-7.90·(0.1mL)^-1。本研究为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞疫苗奠定了基础。     

荧光定量PCR检测鹅细小病毒体系的建立和应用

为解决在养殖过程中多种疫病混合感染造成鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)的临床及实验室诊断困难的问题,利用分离得到的GPV GDGZh1设计合成1对特异性引物GPV-rt PCRF/GPV-rt PCRR,建立了GPV SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并进行了临床样品及GPV在种鹅体内定植规律的检测.结果表明,该方法对质粒的检测灵敏度为3.5×10~2copies/μL,GPV具有组织广泛嗜性,种鹅的直肠、脾脏、心脏、肾脏和卵巢中病毒含量在攻毒后第5天最高,肝脏中病毒含量在攻毒后第9天最高,心脏和肾脏在攻毒后第17天检测不到病毒,直肠、肝脏、脾脏和卵巢在攻毒后第25天还能检测到病毒.这说明种鹅感染GPV后,病毒可以在其体内长期存在,并不断向外排毒,还能通过垂直传播的方式将病毒传递给雏鹅.     

鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

根据鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)3D基因序列,设计合成1对引物,通过优化RT-PCR反应条件,建立了DHV的RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该引物仅特异性扩增出DHV 460 bp的特异性片段,而扩增鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和鹅副粘病毒(GPMV)的核酸扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法能检测到100 pg的DHV核酸;对6份临床病料进行RT-PCR扩增,DHV的检出率为83.33%(5/6)。结果表明:该方法具有良好的特异性和敏感性,可对临床病料中的DHV进行快速检测。     

鹅细小病毒PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中鹅细小病毒(GPV)的7株全基因序列,在相对保守的NS区域设计了一对引物,以GPV-98E株鹅胚尿囊液的核酸提取物为模板,经优化反应条件,建立了特异性检测GPV的PCR方法。敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为4.194 pg,尿囊液的最小检出量为3.09个ELD50;特异性试验结果显示,采用该方法检测GPV能够扩增出与预期大小相符的476 bp的特异性片段,而对作为对照的鸭瘟病毒(DPV)、禽流感病毒(AIV)、鹅副粘病毒(GPMV)的核酸均未扩增出任何条带。在临床检测中,对52份雏鹅的心、肝、肠等组织进行PCR扩增,能够检测到相应的特异性病毒核酸片段,表明建立的鹅细小病毒PCR检测方法具有敏感性高、特异性强的特点,具有潜在的临床应用价值。     

Pokemon敲减对结肠癌Lovo细胞周期、迁移和侵袭能力的影响

目的观察Pokemon敲减对结肠癌Lovo细胞周期、迁移和侵袭能力的影响。方法转染shRNA质粒构建Pokemon敲减的稳定细胞株Lovo-KD和阴性对照细胞株Lovo-NC,用荧光定量PCR检测Pokemon基因敲减效率,流式细胞术检测细胞周期变化,Transwell实验观察细胞迁移和侵袭能力。结果与Lovo-NC细胞比较,Lovo-KD细胞Pokemon mRNA水平下降65.0%（P〈0.01）,G1期细胞比例升高[（56.7±0.8）%vs（26.7±1.6）%,P〈0.01],迁移细胞数[（8±4）vs（189±19）个/视野,P〈0.01]和侵袭细胞数[（6±3）vs（183±13）个/视野,P〈0.01]减少。结论 Pokemon基因敲减可将Lovo细胞阻滞于G1期,使细胞迁移和侵袭能力显著下降。     

抗番鸭呼肠孤病毒(MDRV)单克隆抗体的制备及应用

【目的】制备抗番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的单克隆抗体,建立番鸭呼肠孤病毒病的间接免疫荧光（IFA）快速诊断方法。【方法】制备MDRV抗原,用之免疫Babl/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用IFA和ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单克隆抗体,检测其生物学特性,应用制备的单克隆抗体建立MDRV IFA快速诊断方法。【结果】筛选到237-11,45-12和3-H3 3株特异性好并能稳定分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中45-12株单抗为IgM亚型,237-11和3-H3株单抗为IgG3亚型。45-12和3-H3 2株单抗具有ELISA特性,效价分别为10-4和10-5;237-11株单抗具有IFA特性,效价达10³。特异性测定结果显示,3株单抗仅与MDRV反应,而与正常细胞培养物（MDEF）、番鸭细小病毒（MPV）、鹅细小病毒(GPV)、禽呼肠孤病毒(ARV) 、鸭副黏病毒（PMV）和鸭肝炎病毒（DHV）均无交叉反应。应用抗MDRV单抗建立的IFA方法与病毒分离法（VI）的符合率为91%。【结论】筛选到2株具有ELISA特性、1株具有IFA特性且能分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了MDRV IFA快速诊断方法,为番鸭呼肠孤病毒病的快速诊断奠定了基础。     

干酪乳杆菌表面展示IBDV VP2蛋白

旨在利用pLA载体将IBDV B87株VP2蛋白展示在干酪乳杆菌表面。首先通过RT-PCR扩增VP2基因片段,测序鉴定正确后,将目的片段构建在pLA穿梭质粒上,命名为pLA-VP2,然后将重组质粒电转化到干酪乳杆菌中,构建IBDV重组干酪乳杆菌。应用SDS-PAGE检测重组菌表达目的蛋白VP2,得到约90 kDa的融合蛋白,与预期结果相符。Western blot结果显示VP2蛋白可以与抗IBDV多抗血清发生特异性反应,具有很好反应原性。流式细胞仪的散射光检测器可以捕捉到pLA-VP2重组菌菌体表面的荧光,且重组菌荧光强度强于pLA菌对照组,应用正态分布函数计算pgsA-VP2融合蛋白的表达效率,约为80%。结果表明IBDV VP2蛋白成功展示在干酪乳杆菌表面。     

鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)NS1基因序列设计合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测GPV核酸的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数达到0.998;对初始模板的检出下限为30个拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与鸭瘟病毒、犬细小病毒、新城疫病毒和鹅副粘病毒均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于2%。用建立的Real-time PCR检测13例GPV感染阳性病例,GPV阳性检出率为100%。表明建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于GPV的病原检测及定量分析。     

应用PCR方法检测鹅细小病毒感染

根据GenBank中发表的GPVB株全基因序列,应用生物学软件Primer5.0设计了针对鹅细小病毒VP3(574bp)的特异性引物,建立了小鹅瘟PCR诊断方法。对鹅细小病毒疫苗株和临床病料样品进行了PCR检测,结果从疫苗株和临床病料样品(7/9)中扩增到与预计大小一致的目的片段,而对照的鹅副粘病毒、新城疫病毒和鸭瘟病毒PCR结果均为阴性,敏感性检测结果表明,该PCR可以检测到0.124ng/L的GPV的核酸模板,因此,所建立的PCR方法特异性强,可用于临床病料的快速诊断。来源于黑龙江不同地区的送检样品检测结果表明,小鹅瘟分布广泛,仍是危害雏鹅的重要病毒性传染病。     

鹅细小病毒PCR诊断方法的初步建立

根据GeneBank上已发表的鹅细小病毒(GPV)基因序列,设计合成1对引物,以GPV阳性毒株鹅胚尿囊液及攻毒后死亡的雏鹅组织,提取DNA并进行PCR,结果产物扩增出的片段与预期片段440 bp大小相符,测定序列与GeneBank上GPV B株同源性达99%。试验结果显示用该方法可以特异性地诊断出GPV,比琼脂扩散试验(AGP)敏感性高,可检测最低浓度为102.5GELD50/0.2mL;检测攻毒后死亡的雏鹅组织,在脑、肝、肺、肾、肠等组织中均有GPV的存在,可以用于临床可疑病毒的分离鉴定。所建立的PCR方法具有高度的特异性、敏感性和可重复性。     

Isolation of Goose-origin scFv Antibodies Against Goose Parvovirus from Bacterial Display Antibody Libraries

Goose parvovirus (GPV) can cause a highly contagious and fatal gosling plague (GP) disease in goslings and muscoy ducklings.Here,three goose-origin neutralizing single chain variable fragment (scFv) antibodies against GPV SYG-61 were isolated.The genes of scFv antibodies were derived from goslings immunized with GPV SYG-61,and scFvs were subcloned into a pBSD vector for the construction of pBSD-scFv libraries.The pBSD-scFv libraries were screened following three rounds using VP2 (protective antigen of GPV) as the bait by flow cytometry (FCM).After screening,the 15 clones with high mean fluorescence intensity (MFI) were isolated and sequenced.These 15 scFvs were expressed by pET-28a (+) in E.coli.The specificity and affinity of the 15 purified scFvs were successfully confirmed by ELISA.In the preliminary neutralization experiment on primary goose embryo fibroblast (GEF) in vitro,three of the 15 purified scFvs (named scFv-10,scFv-11 and scFv-50) showed significant neutralizing capacities.The study generated the first goose-origin neutralizing scFv against GPV and laid the foundation for the appearance of full-length goose-origin neutralizing monoclonal antibody against GPV.