干酪乳杆菌表面展示IBDV VP2蛋白

旨在利用pLA载体将IBDV B87株VP2蛋白展示在干酪乳杆菌表面。首先通过RT-PCR扩增VP2基因片段,测序鉴定正确后,将目的片段构建在pLA穿梭质粒上,命名为pLA-VP2,然后将重组质粒电转化到干酪乳杆菌中,构建IBDV重组干酪乳杆菌。应用SDS-PAGE检测重组菌表达目的蛋白VP2,得到约90 kDa的融合蛋白,与预期结果相符。Western blot结果显示VP2蛋白可以与抗IBDV多抗血清发生特异性反应,具有很好反应原性。流式细胞仪的散射光检测器可以捕捉到pLA-VP2重组菌菌体表面的荧光,且重组菌荧光强度强于pLA菌对照组,应用正态分布函数计算pgsA-VP2融合蛋白的表达效率,约为80%。结果表明IBDV VP2蛋白成功展示在干酪乳杆菌表面。     

BRSV和BPIV-3双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速诊断牛呼吸道合胞体病毒(BRSV),牛副流感病毒3型(BPIV-3)病毒病的方法,根据Genbank中登录的BRSV核衣壳蛋白N基因序列和BPIV-3的核衣壳蛋白N基因序列,利用分子生物学软件Primer5.0设计2对特异引物,经过条件优化,建立了BRSV和BPIV-3的双重PCR检测方法。采用该方法检测BRSV和BPIV-3参考毒株,特异性良好。对参考毒株进行梯度稀释检测,结果该方法检测BRSV的敏感性可达10 TCID50·100μL-1,BPIV-3可达10 TCID50·100μL-1。应用建立的双重PCR方法能够从临床样品中检测出BRSV和BPIV-3。表明建立的双重PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于BRSV和BPIV-3的临床检测。     

截短NDV F蛋白的原核表达

根据NDVLaSota株F基因已知的抗原表位,对F蛋白进行分段表达。应用RT—PCR方法分段扩增F基因,并将其克隆到pET30a（＋））原核表达载体上,得到重组质粒pET30-F780和pET30-F760,将质粒导人BL21（ED3）感受态中,经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白通过SDS—PAGE和Westem—blotting方法进行鉴定。表达的两段蛋白大小约为31．1kDa和27．9kDa,与预期的蛋白分子量大小相符。Westernblot分析表明重组蛋白可以和NDV抗体发生特异性反应。成功构建了原核表达质粒pET -F780和pET—F760并获得了高效表达,通过Westernblot分析表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。     

检测牛奶中布鲁氏菌套式PCR方法的建立

为检测牛奶中的布鲁氏菌,通过对布鲁氏菌外膜蛋白31 k Da的一段基因进行套式PCR扩增,建立从临床奶样中检测布鲁氏菌的方法。改进了奶样中布鲁氏菌基因组DNA的提取方法,通过正交试验的方法优化了套式PCR试验的反应条件,优化后的一扩PCR反应条件为:退火温度56.4℃,Mg~(2+)浓度1.5 m M,rTaq酶0.2μL,引物0.3μM,d NTP浓度0.2 m M;二扩PCR反应条件为:退火温度53.3℃,Mg~(2+)浓度1.5 m M,rTaq酶0.25μL,引物0.4μM,d NTP浓度0.1 m M。其敏感性为8 CFU·m L~(-1),比细菌分离试验敏感1 000倍;与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、隐秘杆菌和克雷伯氏菌均无交叉反应;与试管凝集试验检测布鲁氏菌病的阳性符合率是100%,阴性符合率是86.36%。试验建立的套式PCR方法可用于检测奶样中布鲁氏菌。     

牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速诊断牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)病的方法,根据GenBank中登录的IBRV保守基因gB序列,利用分子生物学软件Primer5.0设计1对特异引物,优化反应体系后,建立了IBRV PCR检测方法。特异性试验结果显示该方法可从IBRV DQ株中扩增出398 bp的特异性片段,而对牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、MDBK细胞的扩增结果均为阴性。该方法检测IBRV的敏感性可达10-3 TCID50·mL-1。应用建立的PCR方法能够从发病的临床样品中检测出IBRV且比病毒分离方法更为敏感,操作简便。结果表明建立的PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于IBRV的临床检测。