应用RT-PCR技术扩增禽传染性支气管炎病毒S_1基因的研究

选择Ｓ１基因做为目的基因,运用ＲＴ－ＰＣＲ技术分别扩增１２株以非免疫鸡胚繁殖并通过超速离心浓缩的鸡胚尿囊液中的ＩＢＶ,所用引物为ＩＢＶＢｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列,跨幅为１．７２ｋｂ。结果６株ＩＢＶ毒株（ＳＡＩＢ３、Ｆ、Ｄ４１、Ｍ４１、Ｈ５２、Ｈｏｌｔｅ）扩增出了长约１．７ｋｂ的Ｓ１基因片段,而另６株ＩＢＶ毒株虽经４次ＲＴ－ＰＣＲ重复后也显阴性。用ＨａｅⅢ内切酶对６个毒株的ＲＴ－ＰＣＲ产物进行酶切,结果显示Ｍ４１、Ｈ５２、Ｄ４１３个ＩＢＶ毒株的Ｓ１基因包含两个ＨａｅⅢ位点,Ｆ株与Ｈｏｌｔｅ株Ｓ１基因包含１个ＨａｅⅢ位点,而ＳＡＩＢ３株Ｓ１基因则已丢失ＨａｅⅢ位点。实验结果表明：运用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测ＩＢＶ时,由于Ｓ１基因的核酸序列具有较高的变异率,因此Ｓ１基因不宜做为目的基因。     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方性流行毒株S1基因的RT—PCR扩增及其 …

采用ＲＴ－ＰＣＲ方法,以ＩＢＶ Ｓ１全基因特异性引物分别从我国华东,华北,华中,华南,西北及东北等地的ＩＢＶ流行株基因组中扩增出预期的１．７ｋｂ左右的ＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物的ＨａｅⅢ酶切分析及其与英国ＩＢＶ Ｓ１全基因核酸探针的分子杂交证实所获６个ＩＢＶ流行株的ＰＣＲ产物为ＩＢＶ Ｓ１基因。将此６个毒株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物分别进行５‘和３’端的ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切识别位点的分子修饰之后插入到     

RT-PCR检测禽传染性支气管炎病毒

用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ,分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０、２２８、６０２ｂｐ的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、Ｃｏｎｎ、Ｇｒａｙ、Ｔ、Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒、上毒、云毒、ＨＫ、１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果除Ｈｏｌｔｅ株和２个分离株（宜毒、云毒）外,其余均成功地扩增出６００ｂｐ的片段。用１．７、０．２、０．６ｋｂ３对引物对６个ＩＢＶ毒株和６个分离株的含毒尿囊液在相同和不同条件下进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果３对引物分别扩增出３、５、９株ＩＢＶ,同时可将不同血清型的１２个ＩＢＶ株分成６种基因型。将ＩＢＶ分离株ＨＫ与标准株Ｍ４１经ＰＣＲ扩增、ＨａｅⅢ和Ｈｉｎｄ酶切、ＲＦＬＰ分析,表明属同一马萨诸塞血清型。３株ＩＢＶ（Ｈ１２０,ＨＫ,Ｍ４１）在鸡胚中繁殖,ＰＣＲ最早检出的时间为２０～２４ｈ。ＲＴ－ＰＣＲ提供了直接从尿囊液和感染鸡组织中快速检测病毒的新方法。     

RT—PCR一步法检测鸡传染性支气管炎病毒的研究

根据已发表的ＩＢＶＳ基因核苷酸序列,自行设计合成了一对跨幅约０．９ｋｂ的引物。该区段包括了Ｓ１基因Ｃ末端的４００ｂｐ和Ｓ２基因Ｎ末端的５００ｂｐ。用该引物对５株ＩＢＶ参考毒株Ｇｒａｙ、Ｍ４１、Ｈ１２０、Ｈ５２和ＭＡ５进行ＲＴ－ＰＣＲ一步法扩增均获得预期的ＰＣＲ产物,该引物的ＲＴ－ＰＣＲ灵敏度检测结果表明,可以检测出０．１１２ｐｇ／μＬ的模板。用该引物对３０个地方分离株进行检测,１８株呈阳性,与鸡胚传代及电镜观察结果一致。     

中国肾型IBV毒株的基因型及其S1基因的巢式PCR

用本研究建立的ＩＢＶＳ１基因的巢式ＰＣＲ方法鉴定了国内５个肾型传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株。以此５个分离株及３个标准毒株的ＲＴ－ＰＣＲ产物（１７４９ｂｐ，含Ｓ１基因）为模板，１对内部引物经巢式ＰＣＲ都获得１７２９ｂｐ的产物，另１对内部引物的巢式ＰＣＲ有大小不同的产物（１６７８ｂｐ或０．５、０．６ｋｂ）。参照以前的ＲＦＬＰ分析结果，探讨了中国肾型ＩＢＶ毒株的基因型状况。     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方性流行毒株S1基因的RT-PCR扩增及其克隆与鉴定

采用ＲＴ－ＰＣＲ方法,以ＩＢＶＳ１全基因特异性引物分别从我国华东（ＨＤ）、华北（ＨＢ）、华中（ＨＺ）、华南（ＨＮ）、西北（ＸＢ）及东北（ＤＢ）等地的ＩＢＶ流行株基因组中扩增出预期的１．７ｋｂ左右的ＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物的ＨａｅＩＩ酶切分析及其与英国ＩＢＶＳ１全基因核酸探针的分子杂交证实所获６个ＩＢＶ流行株的ＰＣＲ产物为ＩＢＶＳ１基因。将此６个毒株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物分别进行５’和３’端的ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩ酶切识别位点的分子修饰之后插入到克隆质粒ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ位点,在大肠杆菌中实现了目的基因的分子克隆。Ｓ１基因的ＲＦＬＰ分析表明我国ＩＢＶ已有分子水平的变异。     

用地高辛标记的核酸探针从尿囊液和组织中检测传染性支气 …

将ＩＢＶＴ株基因组Ｓ１基因上０．６kb片段（位于Ｓ１基因上１１２１bp～１７２３bp之间）克隆到ＰＩＢ－ＰＣＲ Ｃloning vector中,用地高辛标记探针,分别与９株ＩＢＶ 的ＰＣＲ产物和１２株ＩＢＶ的核酸进行点杂交均呈阳性反应,而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＲＮＡ,ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液的抽提物反应。探针检测ＩＢＶ－ＰＣＲ产物的灵敏度为１００～２００pg。用该探针检测不同毒株ＩＢＶ在鸡胚中的繁     

鸡传染性支气管炎病毒SY毒株S1基因的RT-PCR扩增与克隆

利用 ＩＢＶ Ｓ１基因特异性寡聚核苷酸引物,经 ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增鸡传染性支气管炎病毒 ＳＹ毒株 Ｓ１基因,得到预期的１．７ｋｂ片段。并将扩增所得ｃＤＮＡ插入克隆质粒载体ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ酶切位点,在大肠杆菌ＤＨ_(5a)中实现目的基因的克隆,获得ＳＹ毒株Ｓ１基因重组质粒。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆和鉴定

以鸡胚成纤维细胞培养ＩＢＤＶ弱毒疫苗株Ｄ７８，经蔗糖密度梯度离心纯化，电镜下见典型ＩＢＤＶ粒子。用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒基因组，低熔点胶回收，琼脂糖凝胶电泳，可见ＩＢＤＶ典型双节段基因组。根据已发表的ＩＢＤＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＩＢＤＶＶＰ２基因的引物。以ＩＢＤＶ基因组为模板，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物，将ＰＣＲ产物适当处理后与经ＳｍａⅠ酶切的ｐＵＣ１９质粒平端连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，在含Ａｍｐ、Χ－ｇａｌ和ＩＰＴＧ的琼脂平板上培养，产生大量白色菌落。挑取白色菌落，经质粒大小比较分析初步筛选到一重组质粒。以重组质粒ＤＮＡ为模板作ＰＣＲ检测和部分酶切分析证实，该质粒为含Ｄ７８ＩＢＤＶＶＰ２基因的重组ｐＵＣ１９     

PCR方法快速检测鸡传染性支气管炎病毒

本试验建立了一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的通用性ＰＣＲ方法。通过对纯化后ＩＢＶ核蛋白基因进行直接ＰＣＲ及套式ＰＣＲ扩增表明，两次ＰＣＲ产物的大小为０．７ｋｂ和０．５ｋｂ，与实际设计相符。而对照的ＮＤＶ及ＩＢＤＶ的ＰＣＲ扩增产物均为阴性。用 ＩＢＶ ＨＢ株感染 ＳＰＦ鸡后，应用我们所建立的 ＰＣＲ方法去检测不同时期所采集的肾脏、气管、盲肠扁桃体、肺脏和肝脏中的 ＩＢＶ，在 ＳＰＦ鸡感染 ＩＢＶ后的２１天仍然能够检测到 ＩＢＶ的基因组，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ杂交试验证明了我们获得的 ＰＣＲ产物为ＩＢＶ的核蛋白基因。该ＰＣＲ检测方法比免疫荧光抗体（ＦＡ）法更具敏感、特异、快速等特点，完全适用于不同来源及不同血清型ＩＢＶ的检测。     

传染性支气管炎病毒Holte株S1基因的克隆及鉴定

为给鸡传染性支气管炎（ＩＢ）基因工程疫苗的研制提供基因储备,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出ＩＢＶＨｏｌｔｅ株Ｓ１基因ｃＤＮＡ,其长度与理论值１７６２ｂｐ相符;Ｓ１基因内部位点经ＨａｅⅢ酶切所产生的片段,亦与理论值５４９、３４３、３２４、１９１、１８０、１７１ｂｐ６个片段大小一致。将Ｓ１基因ｃＤＮＡ克隆入ｐＵＣ１８,并对Ｓ１基因两翼进行了序列分析。结果表明,所克隆的Ｓ１基因与ＧｅｎＢａｎｋ中收录的ＩＢＶＨｏｌｔｅ株Ｓ１基因完全相符。     

病鸡血清中鸡传染性贫血病病毒DNA的PCR扩增及抗体的ELISA检测

根据鸡传染性贫血病病毒（ＣＡＶ）的基因结构，设计并合成一对限制扩增长度为０．６８ｋｂ的ＰＣＲ引物．直接对临床可疑病鸡的血清进行靶ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增．在不同地区的３批样品中，有２批扩增出一二分子量接近０．７ｋｂ的单一特异性ＤＮＡ片段．用限制酶ＢｇｌⅡ消化ＰＣＲ产物．可获得分子量分别为０．３３ｋｂ和０．３５ｋｂ两个ＤＮＡ片段，其酶切位点与靶ＤＮＡ的相吻合．将ＰＣＲ扩增为阳性的病料接种６日龄ＳＰＦ鸡胚，并取其１８日龄胚肝和由接种鸡肛孵出的雏鸡的血清重新进行ＰＣＲ扩增，结果均为阳性，而同期对照胚肝及雏鸡血清为阴性．此外还用胚胎时接种过病料的雏鸡肝、脾和胸腺等组织抽提液作抗原，建立了检测ＣＡＶ血清抗体的ＥＬＩＳＡ方法．研究结果提示，用ＰＣＲ直接对病鸡血清中ＣＡＶＤＮＡ的扩增以及ＣＡＶ抗体的ＥＬＩＳＡ检测是快速和特异的．它为鸡传染性贫血病（ＣＩＡ）的流行病学调查、实验室诊断、ＣＡＶ毒株的分离和鉴定提供了必要的检测手段．     

鸡传染性支气管炎病毒华南分离株核蛋白基因的序列测定及同源 …

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）核蛋白基因序列，设计并合成１对引物。应用这对引物，以ＲＴ－ＰＣＲ特异性扩增出华南分离株（ＨＮ株）的核蛋白基因，基因产物大小为１．５ｋｂ，与设计相符。对ＨＮ株部分核蛋白基因进行序列测定，并与标准毒株Ｈ５２，Ｍ４１，Ｂｅａｕ和Ｇｒａｙ的核蛋白基因进行同源性比较，结果表明，ＨＮ株与Ｈ５２、Ｍ４１、Ｂｅａｕ和Ｇｒａｙ株的核酸同源性分别为８５％、８４％８４％和８     

鸡传染性支气管炎北京地方株S1基因的克隆与鉴定

利用反转录套式聚合酶链反应技术从北京地区３株鸡性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株中扩增出１０５４ｂｐＳ１基因高变区。利用限制性内切酶ＳｉｎＩ和ＰｓｔⅠ的酶切位点分析图谱进一步证实了ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ的特异性。将３段Ｓ１基因分别克隆到ＰＵＣ１９质粒中,获得重组质粒ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ１,ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ２和ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ３。     

传染性法氏囊病病毒超强毒HZ株和XN株VP2基因的克隆和序列比较

根据已发表的５２／７０株ＩＢＤＶ基因组序列,设计并合成了一对特异扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２基因的引物。以陕西地区分离的ＩＢＤＶ野毒ＸＮ株,ＨＺ株为材料,以其基因组为模板利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物,将ＶＰ２基因克隆于ＰＵＣ１１９质粒上,得到重组ＰＵＣ１１９质粒。     

应用反转录聚合酶链反应检测鸡传染性支气管炎病毒核酸的研究

根据国外报道的鸡传染性支气管炎病（ＩＢＶ）Ｇｒａｙ株的纤突蛋白（Ｓ１）核苷酸序列，自行设计合成了Ｓ１蛋白主要抗原决定簇基因两侧的１对引物，跨幅为１．０ｋｂ。用该引物对从内蒙古、天津、山东等地分离的３株ＩＢＶ进行ＲＮＡ提取，反转录后ＰＣＲ，经琼脂糖凝胶电泳结果表明，３株毒株均获得了与预期一致的ＰＣＲ产物；此外，ＩＢＶＰＣＲ灵敏度的测定结果表明，ＰＣＲ方法可检测出１０ｐｇ的模板，ＰＣＲ酶切结果为，ＨａｅⅢ、ＴａｇⅠ酶对３株ＰＣＲ产物均有１个酶切位点，而ＭｓＰⅠ酶无酶切位点     

PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒

利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。     

传染性支气管炎病毒类M_(41)地方分离株S_1基因克隆及高变区序列分析

传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株ＱＤ经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出约１．７ｋｂＳ１糖蛋白基因ｃＤＮＡ，修饰后插入ｐＵＣ１８ＳｍａｌⅠ／ＥｃｏＲＩ位点构成质粒ｐＵＣＱＤＳ１。对克隆的Ｓ１基因５′端高变区序列测定显示，起始密码上游６０碱基和下游３８０碱基中与参考株Ｍ４１Ｓ１基因序列仅有１个碱基的差异，表明ＱＤ为一类Ｍ４１分离株。     

传染性支气近炎病毒类M41地方分离株S1基因克隆及高变区序列分析

传染性支的管炎病毒（ＩＢＶ）分离株ＱＤ经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出约１．７ｋｂＳ１糖蛋白基因ｃＤＮＡ，修饰后插入ｐＵＣ１８ＳｍａｌⅠ／ＥｃｏＲＩ位点构成质粒ｐＵＣＱＤＳ１。对克隆的Ｓ１基因５′端高变区序列测定显示，起始密码上游６０碱基和下游３８０碱基中与参考株Ｍ４１Ｓ１基因序列仅有１个碱基的差异，表明ＱＤ为一类Ｍ４１分离株。     

鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株生物学特性及其免疫原S1基因的克隆与序列分析

本研究对分离自沈阳地区的一株传染性支气管炎病毒（ＳＹ毒株）进行了生物学特性的研究,同时成功地对其免疫原Ｓ１基因进行了ＲＴ－ＰＣＲ扩增、克隆与序列分析。 通过电镜观察、动物回归试验、血凝特性研究等试验验证分离自沈阳地区的ＳＹ毒株确实为一株传染性支气管炎病毒。气管环组织培养交叉中和试验结果表明,分离株ＳＹ株不同于参考毒株澳大利亚Ｔ、Ｈ５２、Ｍ４１,且不同于国内其它流行株ＨＤ、ＨＢ、ＸＢ、ＤＢ等,是一个新的变异株。 利用ＩＢＶ Ｓ１基因特异性寡聚核苷酸引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＳＹ毒株的Ｓ１基因,得到预期的约１．７Ｋｂ片段;并将扩增所得ｃＤＮＡ插入克隆质粒ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ位点,在大肠杆菌ＤＨ５ａ中实现目的基因的克隆。经限制性核酸内切酶分析及ＰＣＲ鉴定,证实为阳性重组质粒,利用末端双脱氧链终止法对其测序,得到Ｓ１基因全长１６４０ｂｐ,包括整个开放阅读框。通过序列分析软件ＤＮＡＳＩＳ、ＰＲＯＳＩＳ、ＭＥＧＡ等软件对Ｓ１基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明：分离株ＳＹ与７株参考株和国内流行株ＨＤ株相比,无论是核苷酸序列同源百分率还是氨基酸序列同源百分离都较低,均未达到８０％,这就提示我们ＳＹ毒