病鸡血清中鸡传染性贫血病病毒DNA的PCR扩增及抗体的ELISA检测

根据鸡传染性贫血病病毒的基因结构，设计并合成一对限制扩增长度为０．６８ｋｂ的ＰＣＲ引物，直接对临床可凝病鸡的血清进行靶ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增。     

鸡传染性喉气管炎病毒中国王岗株gX基因的克隆及鉴定

以ｐＵＣ１９质粒为载体克隆鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）中国王岗株的ＤＮＡ，构建了鸡传染性喉气管炎病毒ＤＮＡ的ＫｐｎⅠＤＮＡ文库。参考ＩＬＴＶ－ＳＡ２株ｇＸ基因的核酸序列，设计并合成了分别为１２ｂｐ和１３ｂｐ的１对引物。以ＩＬＴＶ中国王岗株ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ方法特异性地扩增出０．８４ｋｂ的ＩＬＴＶ－ｇＸ基因片段。以地高辛标记该０．８４ｋｂ的片段为探针，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交从ＩＬＴＶ中国王岗株ＫｐｎⅠＤＮＡ文库中筛选出３个含５．２ｋｂ外源ＩＬＴＶＤＮＡ片段的ｇＸ基因阳性重组子。经酶切分析、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、ＰＣＲ检测和该片段部分酶谱分析表明，ＩＬＴＶ中国王岗株ＤＮＡ５．２ｋｂ的ＫｐｎⅠ片段无论是片段大小还是酶切图谱均与ＩＬＴＶ－ＳＡ２株完全相同，而且Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＰＣＲ检测均为ｇＸ阳性，证明其中含有完整的ｇＸ基因     

产蛋下降综合征（EDS－76）病毒DNA探针的制备及应用研究

用纯化的产蛋下降综合征（ＥＤＳ－７６）病毒（Ｈ９１毒株）悬液提取的核酸，经琼脂糖凝胶电泳只出现１条分子量较大、背景清晰的核酸带。用ＢａｍＨＩ酶消化产生４个片段，大小分别为１７ｋｂ、１０ｋｂ、４．０ｋｂ和２．０ｋｂ。将其中的２．０ｋｂ片段克隆进ｐＵＣ１８ＤＮＡ载体中，重组质粒ＤＮＡ用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记作为ＤＮＡ探针，在ｄｏｔｂｌｏｔ中该探针不与鹅胚尿囊液核酸抽提物、马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＤＮＡ、鸡传染性贫血病毒（ＣＡＶ）ＤＮＡ、ＳＰＦ鸡基因组ＤＮＡ等核酸反应，只与３株ＥＤＳ病毒（ＥＤＳ标准毒株ＡＶ－１２７、ＥＤＳＨ９１毒株和从健康鹅体中分离的ＥＤＳＹ８１毒株）ＤＮＡ呈阳性反应。人工感染产蛋母鸡和雏鸡后２４ｈ即可用该探针从泄殖腔棉拭子样品中检测出ＥＤＳ病毒ＤＮＡ，在感染后３５ｈ仍能从部分感染鸡样品中检出。对部分探针检测阳性鸡的泄殖腔棉拭子样品用ＳＰＦ鸡胚分离病毒，并用ＨＡ和ＨＩ试验检测分离病毒的特异性；在感染过程中，同时检测了血清中ＨＩ抗体的消长情况。结果表明，人工感染鸡排毒至少可以维持２个月左右，而且血清中ＨＩ抗体即使很高，也不能阻止感染鸡的排毒。     

一日龄雏鸡感染鸡盆血病病毒及鸡呼肠病毒的协同作用

１日龄ＳＰＦ来航鸡经口双重感染鸡贫血病病毒（ＣＡＶ）Ｃｕｘ－１株及鸡呼肠病毒（ＲＥＯＶ）Ｓ１１３３或Ｕｃｈｉｄａ株。于接种后第１４天，检查血细胞压积（ＰＣＶ）、称体重、观察骨髓、胸腺及法氏囊病变。结果，双重感染ＣＡＶ及Ｓ１１３３株ＲＥＯＶ的雏鸡与感染其中之一病毒的雏鸡相比，其体重增重少，病变重，而且比仅感染ＣＡＶ的雏鸡在平均ＰＣＶ上也明显低。双重感染ＣＡＶ及Ｕｃｈｉｄａ株ＲＥＯＶ的雏鸡，不加重发病     

PCR和斑点杂交检测鸡传染性贫血病毒

通过聚合酶链反应（ｐｃＲ）扩增鸡传染性贫血病毒（ｃＡＶ）ＤＮＡ特定片段，将此ｐｃＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记后作为探针进行斑点杂交，以此检测ＣＡＶ并作流行病学调查。对从江苏省不同地市随机采集的２月龄左右不同疾病的病鸡ＤＮＡ样品进行检测，在被检的５２个不同鸡群来源的病料中，有３６个鸡群来源的病料ＤＮＡ显示ＣＡＶ阳性（群阳性率为６９．２％）；备组织中ＣＡＶＤＮＡ含量有所差异，依次为胸腺＞脾、骨髓、肝＞肾、法氏囊、脑。用ＰＣＲ检测得到的阳性鸡的组织病料感染ＳＰＦ鸡，在感染后第２４天检查，出现贫血症状。初步调查表明，在江苏一些地区ＣＡＶ感染已相当普遍，但它与发病的关系还有待于进一步研究。     

PCR检测鸡减蛋综合征病毒

根据已报道的鸡减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）病毒ＤＮＡ序列，设计合成了１对引物，建立了ＥＤＳ－７６病毒的双温式聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法。该方法对ＥＤＳ－７６病毒长春株、河南株和广东株扩增结果均为阳性；而对致死鸡胚孤儿病毒（ＣＥＬＯＶ）、鸡病毒性关节炎病毒（ＶＡＶ）、鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）和鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）的扩增结果均为阴性。可检测ＥＤＳ－７６病毒ＤＮＡ为０．３×１０－４ｐｇ。结果表明该方法特异且敏感。此外，将常规的三温式ＰＣＲ的操作规程改为双温式，反应体积由常规５０～１００μＬ改为２０μＬ，使其更加快速、简便、经济     

应用RT—PCR技术扩增禽传染性支气管炎病毒S1基因的研究

选择Ｓ１基因做为目的基因,运用ＲＴ－ＰＣＲ技术分别扩增１２株以非免疫鸡胚繁殖并通过超速离心浓缩的鸡胚尿囊液中的ＩＢＶ,所用引物为ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列,跨幅为１．７２ｋｂ。结果６株ＩＢＶ毒株（ＳＡＩＢ３、Ｆ、Ｄ４１、Ｈ５２、Ｈｏｌｔｅ）扩增出了长约１．７ｋｂ的Ｓ１基因片段,而另６株ＩＢＶ毒株虽经４次ＲＴ－ＰＣＲ重复后也显阴性。用ＨａｅⅢ内切酶对６个毒株的ＲＴ－ＰＣＲ产物     

鸡传染性支气管炎病毒SY毒株S1基因的RT-PCR扩增与克隆

利用 ＩＢＶ Ｓ１基因特异性寡聚核苷酸引物,经 ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增鸡传染性支气管炎病毒 ＳＹ毒株 Ｓ１基因,得到预期的１．７ｋｂ片段。并将扩增所得ｃＤＮＡ插入克隆质粒载体ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ酶切位点,在大肠杆菌ＤＨ_(5a)中实现目的基因的克隆,获得ＳＹ毒株Ｓ１基因重组质粒。     

猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定

根据已发表的ＰＲＲＳＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２株的ＯＲＦ６的基因的引物，以ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２基因组为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ产物。将该ｃＤＮＡ片段经Ｔ－Ａ连接插入ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中，用重组质粒转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９，获得重组质粒转化菌。对重南粒ＤＮＡ进行ＰＣＲ及酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片段与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相     

PCR方法快速检测鸡传染性支气管炎病毒

本试验建立了一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的通用性ＰＣＲ方法。通过对纯化后ＩＢＶ核蛋白基因进行直接ＰＣＲ及套式ＰＣＲ扩增表明，两次ＰＣＲ产物的大小为０．７ｋｂ和０．５ｋｂ，与实际设计相符。而对照的ＮＤＶ及ＩＢＤＶ的ＰＣＲ扩增产物均为阴性。用 ＩＢＶ ＨＢ株感染 ＳＰＦ鸡后，应用我们所建立的 ＰＣＲ方法去检测不同时期所采集的肾脏、气管、盲肠扁桃体、肺脏和肝脏中的 ＩＢＶ，在 ＳＰＦ鸡感染 ＩＢＶ后的２１天仍然能够检测到 ＩＢＶ的基因组，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ杂交试验证明了我们获得的 ＰＣＲ产物为ＩＢＶ的核蛋白基因。该ＰＣＲ检测方法比免疫荧光抗体（ＦＡ）法更具敏感、特异、快速等特点，完全适用于不同来源及不同血清型ＩＢＶ的检测。     

PCR、斑点杂交及间接免疫荧光试验对鸡传染性贫血病临床诊断的应用比较

应用能特异性扩增出鸡传染性贫血病毒（ Ｃ Ａ Ｖ） ０５８ ｋｂ Ｄ Ｎ Ａ 的已知引物，对江苏某地区疑为 Ｃ Ａ Ｖ感染的 １５～３０ 日龄病鸡的肝 Ｄ Ｎ Ａ 样品进行了 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增。结果，在被检的 ２０ 份样品中，有 ６ 份为 Ｐ Ｃ Ｒ 阳性，阳性率 ３０％ 。利用地高辛标记的 ０８５ ｋ ｂ 的 Ｃ Ａ Ｖ 核酸探针对相同样品进行斑点杂交，结果与 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增相同。对应的病鸡血清经间接免疫荧光试验（ Ｉ Ｉ Ｆ Ａ）发现，有 ７ 份为 Ｃ Ａ Ｖ 抗体阳性，与 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增结果的符合率为 ７７％ 。初步结果表明，江苏某地区存在 Ｃ Ａ Ｖ 感染， Ｉ Ｉ Ｆ Ａ 与 Ｐ Ｃ Ｒ 的结果有差异     

马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白D基因的分离克隆,定序及其在大肠杆…

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白（ｇＤ）抗原基因１２０９ｂｐ编码序列。将该ＰＣＲ扩增产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎⅠ位点克隆进行ｐＵＣ１８质粒载体中。将ｇＤ重组ｐＵＣ１８质粒ＤＮＡ用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记后，在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中，该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的Ｂａｍ ＨＩ－Ａ克隆中的Ａ     

鸡贫血病毒荷兰弱毒株基因序列比较研究

用ＣＡ５、ＣＡ６和ＣＡ７、ＣＡ８两对引物对鸡贫血病毒荷兰弱毒株进行ＰＣＲ扩增。将扩增产物１．５ｋｂ和０．８ｋｂ的ＤＮＡ片段分别克隆到ＰＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ载体质粒中,并进行核苷酸序列分析。通过与２６Ｐ４毒株进行核苷酸序列比较发现二者有３２个核苷酸的差异。荷兰和２６Ｐ４两毒株间ＶＰＩ蛋白质同源率为９７％,没有发生特异性变化;ＶＰ３蛋白质同源率为９５％,在Ｉ￣３０个氨基酸之间发生了特异性     

PCR方法快速检测鸡传染性支气管炎病毒

本试验建立了一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的通用性 Ｐ Ｃ Ｒ 方法。通过对纯化后 Ｉ Ｂ Ｖ核蛋白基因进行直接 Ｐ Ｃ Ｒ及套式 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增表明，两次 Ｐ Ｃ Ｒ 产物的大小为０．７ ｋｂ 和０．５ ｋｂ，与实际设计相符。而对照的 Ｎ Ｄ Ｖ 及 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 的 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物均为阴性。用 Ｉ Ｂ Ｖ Ｈ Ｂ株感染 Ｓ Ｐ Ｆ鸡后，应用我们所建立的 Ｐ Ｃ Ｒ 方法去检测不同时期所采集的肾脏、气管、盲肠扁桃体、肺脏和肝脏中的 Ｉ Ｂ Ｖ，在 Ｓ Ｐ Ｆ鸡感染 Ｉ Ｂ Ｖ后的２１ ｄ 仍然能够检测到 Ｉ Ｂ Ｖ 的基因组， Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 杂交试验证明了我们获得的 Ｐ Ｃ Ｒ 产物为 Ｉ Ｂ Ｖ 的核蛋白基因。该 Ｐ Ｃ Ｒ 检测方法比免疫荧光抗体（ Ｆ Ａ）法更具敏感、特异、快速等特点，完全适用于不同来源及不同血清型 Ｉ Ｂ Ｖ 的检测。     

抗原捕捉ELISA与常规方法滴定IBDV的比较

作者建立了两种抗原捕捉酶联免疫吸附试验方法（多抗和单抗ＡＣ－ＥＬＩＳＡ），用于滴定用不同宿主系统增殖的传染性氏囊毒病，这些宿主系统包括ＢＧＭ－７０传代细胞系。鸡胚成纤维细胞和鸡法氏囊，两种检测方法都有较高的特异性，但是多克隆ＡＣ－ＥＬＩＳＡ比单克ＡＣ－ＥＬＩＳＡ更加敏感（Ｐ〈０．０５），结果还表明，滴定ＩＢＤＶ抗原的常规方法（细胞培养物和鸡胚）比多抗ＡＣ－ＥＬＩＳＡ更敏感。     

鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gC和gD基因的克隆及序列分析

根据已发表的传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＳＡ－２株的核酸序列,设计了１对引物,以ＩＬＴＶ－中国王岗株ＤＮＡ为模板,ＰＣＲ法扩增出１条１．３９ｋｂ的基因片段,将扩增产物插入到真核表达质粒ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＤ,另将克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ质料中的ｇＣ基因酶毁后,插入到ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ载体,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＣ,经电泳分析、酶分、ＰＣＲ鉴定后,进行序列测     

减蛋综合征病毒套式PCR检测技术的研究

从ＧｅｎｅＢａｎｋ的１段含六邻体蛋白基因、蛋白酶基因、ＤＮＡ结合蛋白基因的序列中，应用Ｐｒｉｍｅｒ软件设计了２对引物。用这２对引物在分别对反应体系成分和聚合酶链反应（ＰＣＲ）试验条件进行优化后，成功地建立了减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）套式ＰＣＲ检测技术。对鹌鹑源ＥＤＳＶＱＡＶｃ－９４株、ＡＶ－ｘｂ西北分离株、ＡＶ－１２７国际标准株扩增结果，第一轮ＰＣＲ得到约２９０ｂｐ的特异性片段，第二轮ＰＣＲ得到约９０ｂｐ的片段，与预期２８９ｂｐ、８９ｂｐ的设计相符合。而传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）疫苗株Ｂ８７、鸡亲城疫病毒（ＮＤＶ）Ⅳ系疫苗株（ＬａＳｏｔａ）和正常尿囊液等对照的扩增结果均未显示任何扩增条带，有很好的特异性。所建立的套式ＰＣＲ检测方法具有特异、快速的优点，其灵敏度比常规ＰＣＲ灵敏１００倍，可检测出０．０１ｆｇ的     

鸡贫血病毒DNA的PCR扩增及其分子克隆

用ＰＣＲ方法扩增了国内分离的鸡贫血病毒（ＣＡＶ）ＳＪ１株的含ＶＰ２、ＶＰ３以及部分ＶＰ１的１５００ｂｐＤＮＡ片段。经限制性内切酶酶切分析，该片段与Ｃｕｘ－１株的酶谱相似。同时，以ｐＵＣ１１９质粒载体克隆了这一ＤＮＡ片段。     

禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA疫苗的免疫原性

禽流感病毒（ＡＩＶ）的表面结构蛋白血凝素（ＨＡ）是其主要保护性抗原。本研究参考已发表的Ｈ７亚型ＡＩＶ的ＨＡ基因序列，设计合成了１对Ｈ７ＨＡ特异引物，以ＡＩＶＡ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ－Ｑ／９８３／７９／（Ｈ７Ｎ１）（Ａ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ）核酸为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出１条１．７ｋｂｃＤＮＡ片段。将这一片段定向克隆到ｐＵＣ１８中，对其５′端及３′端部分序列测定后，确证其为ＨＡｃＤＮＡ。将ＨＡ基因置于ＳＶ４０启动子和增强子下游，构建了这一基因的真核表达质粒ｐＳＶＨ７。以此质粒１００μｇ肌肉注射免疫３周龄ＳＰＦ鸡６只，４周后以１００倍鸡胚感染剂量（ＥＩＤ）的ＨＡ基因同源病毒对所有鸡进行攻毒，１周后以棉拭子进行泄殖腔病毒分离；免疫后１～６周每周对所有鸡翅静脉采血，分离血清，检测ＨＩ抗体。结果，１００μｇ免疫组鸡病毒分离数为０／６，对照组为６／６；攻毒后１周免疫组鸡ＨＩ效价为１∶３２～１∶６４，对照组为１∶４～１∶１６。表明所构建的ＨＡ基因表达质粒可作为基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。     

麻雀体内传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及理化特性研究

从传染性法氏囊病（ＩＢＤ）阳性麻雀体内分离到了一株病毒，用传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）单克隆抗体心ＥＬＩＳＡ试验和ＤＩＧ－标记ＩＢＤＶｃＤＮＡ探针班点杂交试验证明该病毒为ＩＢＤＶ。病毒可适应于鸡胚和鸡胚成纤维细胞，产生细胞病变效应（ＣＰＥ）。病毒血清型为Ｉ型，病毒代谢抑制试验证明其基因组为ＲＮＡ，病毒核酸的电泳图谱呈两条特征带。病毒对乙醚不敏感ＰＨ２．０不能灭活可使病毒失感染性，５６℃作用３小时