一株H3N2亚型犬流感病毒的分离鉴定

从北京市延庆区某疑似发生犬流感的德国牧羊犬采集犬鼻拭子,采用鸡胚接种、传代、HI试验、HA和NA基因扩增和序列同源性分析及比格犬回归试验等方法对病毒进行分离鉴定。结果表明,分离的病毒具有HA活性,且HA活性可被H3亚型禽流感病毒阳性血清所抑制(HI抗体效价为1∶160),与H1、H5、H7亚型禽流感病毒阳性血清和犬流感阴性血清HI试验均为阴性反应(HI抗体效价1∶10)。分离病毒HA基因、NA基因与A/canine/Georgia/89750.1/2017(H3N2)毒株HA、NA基因的同源性均为99.8%。攻毒后第4天开始,2只犬均出现体温升高、咳嗽、流鼻和精神沉郁等临床症状,并从鼻拭子中分离到病毒,该病毒是一株H3N2亚型的犬流感病毒,将其命名为A/canine/China/Huabei-170607/2017(H3N2)。     

2007年华北地区H3N8亚型马流感病毒的分离与鉴定

2007年10月,华北地区某赛马场的马同时发生了以发烧、流水样鼻汁或脓性分泌物、咳嗽等临床症状为主的疾病,疑似马流行性感冒。采集患病赛马的鼻腔分泌物,发病期和发病后14d血清,经鸡胚接种法分离病毒,并用鸡红细胞血凝抑制试验(HI)、神经氨酸酶抑制试验(NI)、病毒回归试验、血清学检测和基因序列分析对分离的病毒进行了系统鉴定。结果表明分离的毒株(A/equine/Huabei/1/2007(H3N8)为马源H3N8亚型马流感病毒,基因型属于美洲分支。我们通过动物回归感染试验建立起分离毒株的实验感染模型。     

马流感病毒（H3N8亚型，Huabei株）对马的致病性研究

为研究从华北地区分离的H3N8亚型马流感病毒（Huabei株）对马的致病性,分别用E2、E3、E4、E5及E10代病毒液人工感染健康马,比较了不同代次毒株对马的致病性差异.研究表明,E2、E3代病毒以10^7.2～ 10^7.4EID50剂量经喷雾途径可使12 ～ 18个月龄的马出现持续性发热、咳嗽和流浆液性鼻液等典型马流感症状;同样剂量的E4、E5和E10代病毒感染马匹后仅表现为流浆液性鼻液.本研究确定了马流感病毒Huabei株的感染剂量及代次,为马流感灭活疫苗效果评价奠定了实验感染模型基础.     

广西1株H3N8型马流感病毒的分离与鉴定

对具有流感临床症状的病马组织经处理后接种SPF鸡胚,分离到1株流感病毒。该病毒经鸡胚接种7代后,出现稳定的对鸡红细胞凝集效价,效价为25,能被H3亚型血清中和,与H1、H5、H7、H9亚型阳性血清无交叉反应;对HA基因及NA基因进行序列分析,结果显示:HA基因与马流感病毒H3亚型同源性最高,NA基因与马流感病毒N8亚型同源性最高,判断该病毒属于H3N8亚型马流感病毒,命名A/EQ/Guangxi/01/09。     

悬浮培养MDCK细胞制备的H9亚型禽流感灭活疫苗免疫剂量试验

为研究由悬浮培养的MDCK细胞制备的H9亚型AIV抗原所制备的灭活疫苗的免疫剂量,在生物反应器中悬浮培养MDCK细胞,接种H9亚型禽流感病毒WD98和HN04种毒,收获抗原液,以2种抗原液分别制备2个毒株的单价油佐剂灭活疫苗。每种疫苗均按照0.3、0.2、0.1、0.05mL/只(107.5 EID50/只~105.52 EID50/只)的剂量接种21日龄SPF鸡,免疫接种后3周采血测定AIV的HI抗体,采血后分别用与制苗株同源的H9亚型AIV种毒静脉注射攻毒,测定疫苗保护率。2种疫苗不同剂量免疫接种后21d的AIV HI抗体水平达到3.8log2~5.6log2,对照组鸡AIV HI抗体均为0log2。攻毒试验证实,以105.52 EID50/只~107.5 EID50/只剂量进行免疫接种,免疫鸡只获得了80%以上的保护。按照兽药典H9亚型禽流感疫苗攻毒保护率90%为合格的标准,悬浮培养MDCK细胞制备的H9亚型禽流感疫苗的最小免疫接种剂量为106.82 EID50/只。     

广西马源H9亚型流感病毒的血清学调查

为了解广西马源H9亚型流感病毒的感染情况,本研究从广西4个主要养马地区采集马血清样品共计1 110份,采用血凝抑制(HI)试验方法进行抗体检测。结果显示,1 110份血清样品中共检测出阳性血清7份,平均抗体阳性率为0.54%。本实验结果表明,广西马群已受到H9亚型流感病毒的感染。     

Re-8株H5亚型禽流感灭活疫苗对野鸟源H5N8流感病毒的免疫保护性研究

为评估当前应用的Re-8株种毒相关禽流感灭活疫苗对野鸟源H5N8流感病毒的免疫预防效果,本研究将重组禽流感病毒(AIV)H5亚型Re-8株灭活疫苗(H5N1亚型,Re-8株)和重组AIV(H5+H7)灭活疫苗(H5N1Re-8株+H7N9 H7 Re-1株)分别以0.3 m L/只的剂量接种3周龄SPF鸡,免疫3周时进行HI抗体检测和攻毒试验。结果显示,上述2种疫苗免疫的SPF鸡血清中针对H5亚型Re-8株抗原的HI抗体均在8 log2以上,以105EID50的剂量、鼻腔感染途径攻击野鸟源H5N8病毒BHG/QH/2/16和BHG/Tibet/3/16后,所有免疫组鸡在14 d观察期内均全部健活,不排毒,而对照组鸡在攻毒后4 d内全部发病、死亡、排毒。现地免疫重组AIV H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)的商品蛋鸡直接进行HI抗体检测和攻毒试验,结果显示,免疫蛋鸡血清中针对Re-8株抗原的HI抗体平均滴度为8.3 log2,以相同攻毒方式和剂量分别攻击2株H5N8病毒后,免疫鸡也获得完全免疫保护,不发病、不死亡、不排毒。本研究结果表明,含有重组AIV H5 Re-8株抗原的灭活疫苗可有效防控野鸟源H5N8流感病毒,为我国及其他国家H5N8亚型禽流感免疫防控提供了科学依据。     

规模化驴场中马流感病毒H3N8亚型感染情况调查

[目的]调查山东省聊城市规模化驴场中马流感病毒的感染情况,并分析其可能的来源。[方法]从聊城的规模化驴场采集病料和血清,通过HI试验检测驴血清中的马流感病毒H3N8亚型抗体的阳性率。使用RT-PCR技术扩增肺脏和鼻腔棉拭子样品中的马流感病毒M基因,对获得的马流感病毒M基因与不同流感病毒的M基因进行序列比对,推测其来源。[结果]HI试验表明,120个血清样品中马流感病毒H3N8亚型血清抗体阳性率为33.3%(40/120);其中,母驴的马流感病毒H3N8亚型血清抗体阳性率为42.5%(17/40)、公驴为32.5%(13/40)、驴驹为25.0%(10/40)。通过RT-PCR检测发现,32.3%(21/65)的样品可测出目的条带。通过序列比对得出,该试验获得的流感病毒M基因与马属动物的H3N8亚型流感病毒高度同源(CY032222、CY032318、CY028821等),同源性最高可达99.8%。[结论]马流感病毒在聊城周边的数个规模化养驴场发生流行。该研究从驴体内分离的流感病毒M基因属于马流感病毒H3N8亚型M基因。     

H7亚型禽流感病毒血凝素基因重组鸡痘病毒活载体疫苗免疫原性评估

本研究以细胞感染-转染技术构建了一株表达H7亚型禽流感病毒(AⅣ)血凝素(HA)基因的重组鸡痘病毒rFPV-HA.以5×105PFU的rFPV-HA经翅下刺种免疫8周龄SPF鸡,免疫后第3周用100 CID5o的HA基因同源AⅣ A/Arfi St/eng-Q/983/79(H7N1)进行人工感染,1周后采集泄殖腔棉拭子进行病毒分离.免疫后第三周及攻毒后第1、2周对所有动物进行静脉采血,检测血凝抑制(HI)抗体和免疫沉淀(AGP)抗体.结果,攻毒前部分rFPV-HA免疫鸡可检测到HI抗体,但检测不到AGP抗体,野生型病毒(F017)接种组和空白对照组HI抗体和AGP抗体均为阴性.攻毒后rFPV-HA免疫组的HI抗体上升速度明显高于野生型病毒接种组和空白对照组.rFPV-HA免疫组有6/8的鸡为流感病毒分离阴性,野生型病毒接种组和空白对照组的试验鸡病毒分离全部为阳性.结果表明rFPV-HA可诱导鸡产生有效的免疫保护反应,阻止或降低消化道病毒排泄.rFPV-HA的成功构建为研制开发H7亚型禽流感活载体疫苗奠定了良好的基础.     

新疆哺乳动物流感病毒血清学监测与分析

为了解新疆地区哺乳动物流感病毒的感染流行情况,本研究于2009年～2011年对新疆6个地区的5种哺乳动物进行流感病毒部分亚型的血清学监测,采集猪血清样品1 519份、马血清样品1 095份、驴血清样品802份、狗血清样品130份和猫血清样品40份.用HI方法进行流感病毒血清学监测.结果表明,猪血清中流感病毒H1亚型抗体阳性率为0～31.5％,H3抗体阳性率为0.75％～5.32％,H5亚型抗体阳性率为0～2.7％,H9亚型抗体阳性率为0～10.19％;马血清和驴血清样品的流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亚型抗体均为阴性;狗血清流感病毒H9抗体阳性率为1.75％;猫血清样品流感病毒H1抗体阳性率为2.5％.     

犬流感病毒重组核蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立H3N2亚型犬流感病毒(CIV)血清学检测方法,本研究利用H3N2亚型CIV重组核蛋白(r NP)作为检测抗原,通过优化反应条件,建立了检测CIV核蛋白血清抗体的间接ELISA方法。通过检测10份SPF犬血清样品确定阴阳性临界值为0.288。该方法检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感毒、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病病毒、犬弓形虫、犬弓首蛔虫、犬复孔绦虫的阳性血清均为阴性,具有良好的特异性,但与H1N1、H3N8和H9N2亚型CIV有交叉反应。该方法检测H3N2 CIV血清抗体的灵敏度为血凝抑制试验(HI)的3~12.5倍;而且其批内批间变异系数为1.85%~6.57%,重复性良好。通过对H3N2 CIV攻毒犬血清进行分析,表明该检测方法具有滞后性,检测到CIV抗体的时间晚于HI试验。利用本研究建立的方法和以H3N2 CIV为诊断抗原的HI检测方法对450份血清样品进行检测,结果显示该方法对血清样品具有初筛作用,两者阳性符合率为58.3%,阴性符合率为100%。本研究可以结合其它血清学方法为CIV流行病学调查进行快速、高效的检测。     

马流感病毒(A/Equine/Qinghai/1/94)神经氨酸酶基因的克隆与同源性分析

本试验根据已发表的马流感病毒神经氨酸酶(NA)基因序列，设计并合成一对特异性引物，经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功扩增出了我国马流感病毒青海株(A／Equine／Qinghai／1／94)NA基因，将片段连接到PGEM—T-easy载体并转化DH5a，提取阳性菌落的质粒经EcRol酶切和PCR鉴定其大小均为1．4Kb左右，对其测序并构建NA基因进化树。经过比较分析发现，我国马流感病毒青海株与A／Equine／Alaska/1／91、A／Equim／Tennessee/5／86和A／Equine／Algiers/72等关系较近，核苷酸同源率为98．2％—97．4％；与我国马流感吉林株(A／Equine／Jilin／1／89)关系较远，核苷酸同源率仅为72．0％；而与H7N7亚型马流感病毒A／Equine／Prague／1／56核苷酸同源率仅为38．0％。     

天津地区猪流感血清学调查

2002年-2005年期间,采用血凝抑制试验对天津市10个区县44个养猪场进行了猪流感病毒抗体检测,结果75%的被调查猪场抗体检测结果有阳性,检测的648份血清样品中,69.6%为阳性。流感病毒抗体亚型调查结果显示该地区流行的猪流感病毒主要为H1和H3亚型,抗体阳性率分别为55.4%和39.4%。部分猪群中存在抗H9亚型流感病毒抗体,阳性率为5.4%,但未发现H5亚型流感病毒抗体。此外,部分猪群中同时存在2种或3种亚型(H1,H3和H9)流感病毒的抗体,表明这些猪曾经同时被2种或3种不同亚型的流感病毒感染。     

马流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种快速、有效的检测马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的方法,以EIV中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)制备的多克隆抗体为捕获抗体,原核表达的核蛋白(NP)制备的单克隆抗体为检测抗体,在国内首次建立了检测EIV的双抗体夹心ELISA方法.用该检测方法分别检测EIV、马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型和马乙型脑炎病毒阳性样品.结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性;与常规检测EIV的血凝试验相比,其敏感性是后者的2.5～10倍;同时与H7N7亚型EIV有交叉反应.攻毒试验结果表明该方法可有效检测鼻腔分泌物中的EIV.该方法的建立为EIV的检测及早期防控提供了有效工具.     

北美H3N8亚型犬流感病毒双重RT-PCR检测方法的建立

H3N8亚型犬流感病毒在北美地区广泛流行,并引发犬的呼吸道疾病,但目前中国尚未有犬感染H3N8亚型犬流感病毒的报道。随着近几年宠物贸易的繁盛,犬流感流行区域可能逐渐扩大,增加北美H3N8亚型犬流感病毒传入中国的可能。因此,需要建立一种针对北美H3N8亚型犬流感病毒的快速检测方法。本研究中,我们建立了针对北美H3N8亚型犬流感病毒的HA和NA基因片段的双重RT-PCR检测方法。该方法可特异性地检出北美H3N8亚型犬流感病毒HA和NA基因,而未检出H3N2亚型犬流感病毒及其他亚型流感病毒、犬瘟热病毒、传染性肝炎病毒、犬细小病病毒、副流感病毒;检测方法灵敏度可达0.1 pg/μL。利用该方法对临床样本进行了检测,证实该检测方法可靠。该检测方法的建立为监测北美H3N8亚型犬流感病毒提供了良好的技术支撑,可用于外来犬流感病毒的检测。     

上海市猪群中猪流感病毒优势亚型的血清学调查

为了解当前本市猪群中猪流感病毒的优势亚型,摸清病毒感染现状和规律,对2011年上海市46个场户的723份猪血清应用血凝抑制试验(HI)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行了检测。结果显示:本地猪群中猪流感病毒的H1亚型为优势亚型,H3亚型病毒感染率较低,被检场户流感病毒抗体的场阳性率为1.25%～100%,样品阳性率为1.3%～74.7%。提示:猪群对H1、H3亚型流感易感,种猪的感染程度明显高于肉猪,未检测到H5、H9亚型流感病毒抗体。     

H9N2亚型禽流感病毒对海兰白鸡感染和传播特性的研究

为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)对海兰白鸡的感染和传播特性,将80只4周龄海兰白鸡随机分为8组,每组10只,其中感染组5只,同居组5只,采用100~107EID50/0.4 m LH9N2 AIV以滴鼻和点眼方式攻毒,24 h后放入同居组。感染14 d内每天进行临床观察,采集咽拭子和泄殖腔拭子用于病毒分离,感染后7、10、14 d测定HI抗体滴度。结果表明:4周龄海兰白鸡感染H9N2 AIV后未出现明显的临床症状;感染剂量为100~101EID50/0.4 m L的感染组和同居组均未分离到病毒;感染剂量为102~103EID50/0.4 m L的感染组排毒期为2~6 d,同居组排毒期为4~6 d;感染剂量为104~107EID50/0.4 m L感染组排毒期为1~6 d,同居组排毒期为2~8 d;感染剂量为102~107EID50/0.4 m L感染组和同居组鸡分别于感染后7和10 d开始产生抗体,第14天感染组和同居组鸡的平均抗体滴度分别为(7.8±1.4)log2和(6.7±1.1)log2。结果显示该毒株使4周龄海兰白鸡全部感染的最低感染剂量为103EID50/0.4 m L,以106EID50/0.4 m L感染鸡,能刺激感染组与同居组产生较高的HI抗体,表明106EID50/0.4 m L H9N2亚型AIV能在海兰白鸡体内建立有效感染和传播。     

检测流感病毒H5亚型抗体竞争ELISA方法的建立及初步应用

本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法.实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27ug/mL(1:800),酶标抗体最佳稀释倍数为1:800,待检血清最佳稀释倍数为1:10.对已知阳性样品的检测结果表明,本研究中所建立的竞争ELISA方法的敏感性高于经典的血凝抑制方法(HI).特异性试验表明该ELISA方法仅能检测H5亚型流感病毒抗体,具有良好的特异性.对临床样品检测表明C-ELISA与HI 方法的符合率达到93%以上.该方法可以对不同种属动物血清H5亚型流感病毒抗体进行快速定量的检测,为H5亚型流感病毒流行病学调查与抗体的检测提供了一种快速、方便、敏感的方法.     

悬浮培养和鸡胚尿囊液抗原制备的H9亚型禽流感疫苗免疫效力比较试验

为了探讨悬浮培养和鸡胚尿囊液培养得到的H9亚型禽流感病毒(AIV)抗原制备的疫苗的免疫效力,试验用3株H9亚型AIV株分别接种微载体悬浮培养的MDCK细胞制备3种悬浮培养的细胞疫苗抗原,以3株H9亚型AIV株接种10日龄SPF鸡胚制备3种鸡胚尿囊液抗原,测定6种抗原液HA效价和鸡胚半数感染量(EID50);分别使用6种抗原液制备灭活疫苗,免疫21日龄SPF鸡,并在免疫后第21天采血测定HI抗体水平,采血后进行攻毒并在攻毒后第5天进行病毒分离试验。结果表明:两种方式制备的AIV抗原HA效价为7~9 lb,鸡胚半数感染量为1×106.9~7.9EID50,疫苗免疫后第21天用同源毒株作为工作抗原测定的免疫鸡HI效价差异不大,用异源毒株测定时有一定差异;两种方法得到的抗原制备的疫苗均能获得很好攻毒保护。     

H3N2亚型犬流感病毒的分离鉴定

为了解广州地区犬流感的流行情况,本研究采集107份犬鼻咽拭子样品和58份血清样品,SPF鸡胚分离病毒并进行抗体检测。结果显示:分离获得3株H3N2亚型犬流感病毒。分离株的EID50为10-2.42/0.1 mL～10-3.5/0.1 mL;MDT为177.6 h～192 h;对乙醚、氯仿、酸和温度均敏感;对血凝素为热不稳定型;能够凝集公鸡、豚鼠、猪和牛的红细胞。