羊口疮病毒B2L基因DNA疫苗的构建及其诱导的免疫应答

为研究所构建羊口疮病毒(OrfV)B2L基因DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答效果,本研究对pMD18T-B2L质粒进行PCR扩增,克隆B2L片段至pVAX1载体中构建pVAX1-B2L重组质粒,进行酶切和测序鉴定;采用脂质体法将pVAX1-B2L真核表达质粒转染MDBK细胞,RT-PCR和IFA法检测B2L基因在MDBK细胞中的转录和表达;将构建的DNA疫苗免疫KM系小鼠,采用间接ELISA、MTT和FACS法对其诱导的免疫应答进行研究。结果显示,成功构建pVAX1-B2L真核表达质粒,并在MDBK细胞中表达;免疫小鼠后,DNA疫苗能诱导小鼠产生OrfV特异性抗体;脾淋巴细胞增殖、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群百分比和IL-2、IFN-γ、IL-4细胞因子均高于pVAX1组和PBS组。结果表明,本研究制备的DNA疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答。     

羊IL-2基因和羊口疮病毒B2L基因真核表达重组质粒联合免疫小鼠的效果评价

为评价羊白介素2(IL-2)基因和羊口疮病毒(OrfV)B2L基因真核表达重组质粒联合接种小鼠的免疫效果,本研究将pVAX1-B2L、pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2及空载体pVAX1和PBS对照组通过肌肉注射的方式免疫KM小鼠,并采用ELISA方法和MTT方法检测免疫小鼠的体液和细胞免疫反应。结果表明,pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价和IL-2水平均显著高于pVAX1-B2L免疫组,与pVAX1和PBS对照组相比差异极显著(p0.01)。而且pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2免疫组的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-B2L免疫组、空载体pVAX1组和PBS对照组(p0.01)。因此,pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2联合免疫KM小鼠可以诱导特异性体液免疫和细胞免疫,并且IL-2具有免疫佐剂的作用,为进一步将其用于Orf的防制奠定了基础。     

羊口疮病毒F1L基因真核表达质粒构建及对小鼠的免疫原性

构建羊口疮病毒F1L基因的真核表达质粒,并探讨其对小鼠的免疫原性。本试验采用PCR扩增pMD18TF1L克隆质粒的F1L基因并将其克隆至pVAX1载体中,构建真核表达质粒并转染至MDBK细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光检测F1L基因在MDBK细胞中的转录和表达。将构建的pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠,通过间接ELISA、MTT和FACS法对该DNA疫苗的免疫效果进行评价。结果表明,成功构建了真核表达质粒pVAX1-F1L,并能在MDBK细胞中获得较高水平的表达。免疫小鼠后诱导的特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖反应、CD4~+、CD8~+细胞百分比和IL-2、IFN-γ、IL-4细胞因子水平均高于pVAX1组和PBS对照组。因此,制备的重组核酸疫苗免疫小鼠后能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。     

羊口疮病毒B2L和F1L截短融合基因原核表达产物的免疫原性分析

为分析羊口疮病毒(OrfV) B2L和F1L截短融合基因表达蛋白的反应原性，本研究分别选取B2L、F1L基因序列的主要抗原区域，采用重叠延伸PCR将二者融合后克隆至原核表达载体pET-32a中，构建重组质粒pET-32a-B2L-F1L，通过PCR、双酶切和测序鉴定，结果显示获得1 080 bp的B2L-F1L融合基因目的片段，测序结果经比对分析正确无误，表明正确构建了重组表达质粒pET-32a-B2L-F1L。将pET-32a-B2L-F1L转化BL21 (DE3)后经IPTG诱导，SDS-PAGE检测结果显示表达了39 ku的重组蛋白rB2L-F1L。采用Ni-IDA亲和层析方法纯化重组蛋白，经western blot鉴定，结果显示获得39 ku的单一特异性条带，表明rB2L-F1L的纯化效果和免疫原性均较好。采用rB2L-F1L纯化蛋白皮下多点注射免疫羔羊，采用ELISA方法检测免疫后不同时间羔羊血清中的OrfV抗体、IL-2、IFN-γ和IL-4细胞因子。结果显示，与生理盐水组相比，rB2L-F1L能够诱导羔羊产生OrfV特异性抗体，并可显著或极显著诱导羔羊分泌IL-2、IFN...     

IL-2和绵羊梅迪-维斯纳病病毒核心蛋白Gag核酸疫苗联合免疫小鼠的免疫应答

构建绵羊梅迪-维斯纳病病毒（MVV）核心蛋白Gag核酸疫苗并与IL．2联合免疫小鼠，为评价其诱导的体液和细胞免疫应答。将MVVgag基因与羊IL-2基因分别插入到核酸疫苗载体质粒pcDNA5．0中，构建真核表达质粒pcDNA5．0-Gag和pcDNA5.0-IL-2，并经酶切以及测序鉴定。分别用阳性质粒pcDNA5．0-Gag、空载体pcDNA5．0及pcDNA5．0-Gag和pcDNA5．0-IL-2共免疫BALB／C小鼠，采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体以及IFN-γ和IL-4水平，用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖。结果表明pcDNA5．0-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价和IFN-γ、IL-4水平高于pcDNA5．0-Gag免疫组，与空载体pcDNA5．0对照组相比有显著差异（P〈0．01）。且pcDNA5．0-Gag单独免疫组及与IL-2联合免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数均高于空载体pcDNA5．0对照组。因此，构建真核表达质粒pcDNA5．0-Gag和pcDNA5．0-IL-2，用其联合免疫BALB／C小鼠所诱导的免疫反应以特异性细胞免疫应答为主，同时可产生体液免疫，且IL-2发挥了免疫佐剂的作用，为进一步将其用于MVV的防治奠定了基础。     

牛病毒性腹泻/粘膜病病毒核酸疫苗的构建及其免疫效果研究

为提高牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD/MD)核酸疫苗的免疫效力,本实验应用PCR方法扩增BVD病毒(BVDV) E0基因,构建真核表达质粒pVAX1-E0,转染293T细胞,经RT-PCR和western blot分析显示,转染细胞能够瞬时表达E0蛋白.并分别将pVAX1、pVAX1-E0或将pVAX1-E0分别与一种表达细胞因子基因的重组质粒作为佐剂(pVAX1-IL-2、pVAX1-IL-4及pVAX1-IFN-γ)免疫小鼠,采用间接ELISA法检测免疫小鼠BVDV抗体效价,以MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性.实验结果表明,与pVAX1-E0相比,接种pVAX1-E0/pVAX1-IL-2小鼠血清E0抗体水平及淋巴细胞增殖水平显著提高(p＜0.01),表明细胞因子基因佐剂IL-2能够有效提高BVDV E0核酸疫苗免疫效果,可以刺激小鼠产生良好的免疫应答.     

重组白介素-2增强口蹄疫病毒多表位疫苗免疫效果研究

通过研究重组白细胞介素-2（IL-2）对口蹄疫病毒（FMDV）多表位疫苗免疫效果的增强作用,为IL-2作为 FMDV 表位疫苗佐剂应用提供实验依据。6周龄雌性 Balb／c 小鼠,分为4组,第1组联合免疫表达猪 IL-2的重组腺病毒（rAd5poIL-2）和串联表达 FMDV 多表位基因的重组腺病毒（rAd5EGS）,第2、3和4组分别注射 rAd5EGS、灭活疫苗和 PBS,间隔2周免疫1次,共免疫3次。首免后每周采血分离小鼠血清,通过 ELISA 检测血清中特异性 IgG;首免后6周检测血清中抗体亚型 IgG1、IgG2a 及细胞因子 IL-4和 IFN-γ的表达水平,同时分离脾细胞,MTT 法检测淋巴细胞增殖指数。结果显示,联合免疫 rAd5poIL-2和rAd5EGS 既能增强 rAd5EGS 诱导小鼠特异性 IgG、IgG1和 IgG2a 的分泌,又能增强其诱导淋巴细胞增殖能力,且免疫效果强于灭活疫苗;细胞因子检测结果显示,联合免疫 rAd5poIL-2后能增强 rAd5EGS 诱导小鼠 IL-4和 IFN-γ的分泌,且其诱导 IL-4和 IFN-γ分泌能力也强于灭活疫苗。说明重组 IL-2能有效增强FMDV 多表位疫苗诱导抗体分泌能力和细胞免疫应答,rAd5poIL-2有望作为 FMDV 表位疫苗的候选佐剂。     

IL-18增强日本血吸虫DNA疫苗Sj23的免疫保护效果

将小鼠IL-18基因和日本血吸虫Sj23膜蛋白基因分别插入pVAX1载体,构建真核表达质粒pVAX/mIL-18和pVAX/Sj23,联合或单独免疫小鼠,以pVAX1空载体作对照,免疫2次,间隔2周,2次免疫后4周攻击日本血吸虫尾蚴.体液和细胞免疫检测结果表明,联合免疫组能诱导小鼠产生较强的抗日本血吸虫成虫可溶性抗原(SWAP)IgG,较高水平的IFN-γ和IL-2.攻虫试验表明,联合免疫小鼠成虫减虫率和肝脏减卵率分别达41.6%和49.4%,明显高于pVAX/Sj23单独免疫组(减虫率和肝脏减卵率分别为26.5%和41.4%).以上试验结果表明,IL-18能明显增强Sj23 DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答,并且产生较强的保护作用.     

山羊IL-2基因真核表达质粒构建及在MDBK细胞中的表达

本实验成功构建了真核表达质粒pVAX1-IL-2,并对质粒进行PCR,双酶切及测序鉴定,RT-PCR成功验证了目的基因在MDBK细胞中能够转录,同时ELISA验证目的基因在MDBK细胞中能表达.研究结果为pVAX1-IL-2作为核酸疫苗的细胞因子佐剂的应用研究提供生物材料.     

气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果评价

为了检测气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果,在成功构建pVAX1-NanA真核表达重组质粒的基础上将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光鉴定其表达,并将成功构建的pVAX1-NanA质粒大量提取后免疫Balb/c小鼠,设置pVAX1-NanA核酸疫苗组、pVAX1空载体组和PBS对照组。对小鼠采血并分离血清,用ELISA测定血清中的IgG、IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平;第3次免疫2周后,用流式细胞仪测定小鼠脾脏中的CD4~+和CD8~+T细胞水平。结果表明,pVAX1-NanA核酸疫苗免疫Balb/c小鼠后,小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P0.01);IFN-γ和IL-4细胞因子水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P0.01);CD4~+、CD8~+T细胞分析表明, pVAX1-NanA免疫组的CD4~+和CD8~+T细胞水平显著高于pVAX1组和PBS对照组(P0.05),pVAX1-NanA核酸疫苗组的CD4~+/CD8~+T细胞比值高于pVAX1空载体组与PBS对照组(P0.05),pVAX1空载体组和PBS对照组之间无显著差异(P0.05)。试验成功制备了pVAX1-NanA核酸疫苗,且pVAX1-NanA核酸疫苗可刺激Balb/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫。     

pVAX1/SjTSP2 DNA疫苗免疫预防小鼠日本血吸虫病的效果评估

为评估SjTSP2分子作为日本血吸虫DNA疫苗候选抗原分子的潜力,本实验扩增了编码该分子的DNA片段,构建了重组真核质粒pVAX1/SjTSP2,检测其在哺乳动物细胞中表达情况后,通过基因枪轰击法免疫小鼠,应用ELISA、流式细胞术等检测重组质粒诱导的免疫反应,计算减虫减卵率,评估对小鼠日本血吸虫病的免疫保护效果。间接免疫荧光试验结果显示该质粒能在293T细胞中表达。质粒免疫小鼠诱导了显著升高的特异性IgG抗体和IFN-γ、IL-4等细胞因子。小鼠免疫保护试验结果表明,免疫组小鼠虫荷数较PBS对照组增加12.4%(P=0.368),但肝组织虫卵减少10.01%(P=0.486)。说明制备的DNA疫苗能刺激小鼠产生较强的免疫反应,但诱导的免疫保护作用并不理想,为血吸虫DNA疫苗研究提供了参考数据。     

丝状支原体山羊亚种LppA蛋白N末端基因真核表达载体构建及小鼠免疫效果分析

基于丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri,Mmc)贵州株的LppA蛋白N末端基因,构建真核重组表达质粒pVAX1-LppA,并对免疫效果进行分析,为防控羊支原体肺炎提供新思路.以构建的真核重组表达质粒pVAX1-LppA(50、100、150 μg)、pVAX1空载体、无菌...     

巨型艾美耳球虫偏菱形样蛋白EmRP免疫原性分析

在前期研究中,从巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)cDNA文库中筛选到了免疫保护性抗原偏菱形样蛋白EmRP,本研究为揭示该抗原的免疫保护机理,进一步检测了其免疫原性。以E.maxima卵囊cDNA为模板,用RT-PCR技术扩增EmRP,并构建真核表达质粒pVAX1-EmRP,将其经腿部肌肉注射2周龄的雏鸡,3周龄加强免疫。分别于首次免疫后和加强免疫后1周,采集血清,用ELISA方法检测血清特异性IgG水平,用荧光定量PCR方法(qPCR)检测细胞因子水平,用流式细胞术检测CD4^+T淋巴细胞和CD8^+T淋巴细胞的比例,分析EmRP诱导的免疫反应。序列分析表明,EmRP含有偏菱形样蛋白超家族成员保守区域,为非跨膜蛋白,分子量约为28.4 kD。真核表达质粒pVAX1-EmRP免疫鸡后,与对照组相比,鸡体IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17等细胞因子转录水平显著提升;CD8^+和CD4^+ T细胞比例显著提高,而血清特异性IgG水平与对照组差异不显著。结果表明,EmRP诱导的免疫保护作用主要是由其诱导的细胞免疫反应实现的,可以作为研制E.maxima新型疫苗的候选抗原。     

纹皮蝇HypoderminC基因真核表达质粒构建及小鼠免疫试验

根据GenBank发表的Hypodermin C(HC)基因序列设计引物,以原核表达载体pET-HC为模板,PCR扩增HC基因,将克隆基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-HC。将重组质粒pVAX1-HC转染小鼠胎儿成纤维细胞,以间接免疫荧光法检测HC基因在细胞中表达。用真核表达质粒pVAX1-HC经双侧胫前肌注射昆明小鼠,对小鼠进行体液免疫和细胞免疫研究。结果表明,小鼠血清抗体水平和淋巴细胞增殖水平明显高于非免疫对照组。本研究成功构建了真核表达质粒pVAX1-HC,为纹皮蝇核酸疫苗研发奠定了基础。     

表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA的构建及免疫效果研究

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA,并测定其免疫效果。将猪附红细胞体ENO基因克隆到PVAX1真核表达载体上,然后转染到Vero细胞中进行表达并测定其免疫效果。将18只BALB/c小鼠（雌雄各半）随机分为3组（PVAX1-ENO质粒DNA免疫组、PVAX1空载体对照组及PBS对照组）,每组6只,每组小鼠对应免疫接种PVAX1-ENO质粒DNA、PVAX1空质粒和PBS。分离血清并通过ELISA方法测定血清中ENO蛋白抗体效价、IgG₁和IgG_2a抗体水平及IFN-γ和IL-4细胞因子水平。三免2周后每组选取3只小鼠检测CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,本试验成功构建了PVAX1-ENO质粒DNA,经PCR和酶切鉴定正确,并能在Vero细胞中成功表达。PVAX1-ENO质粒DNA免疫组ENO蛋白抗体水平、IgG₁和IgG_2a抗体水平、IFN-γ和IL-4细胞因子水平及CD4⁺和CD8⁺含量均显著高于PVAX1空载体对照组及PBS对照组（P<0.05）。结果表明,PVAX1-ENO质粒DNA可显著提高BALB/c小鼠的体液免疫水平,并在一定程度上刺激BALB/c小鼠细胞免疫。     

猪附红细胞体eno基因重组蛋白的制备及免疫效果研究

为了研究猪附红细胞体eno基因重组蛋白的免疫效果,本试验将猪附红细胞体eno基因与pET-15b载体进行连接,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。对表达菌株进行诱导表达、纯化,利用纯化后的猪附红细胞体eno重组蛋白（命名为rMseno）对小鼠进行免疫,从而评价该重组蛋白在小鼠体内产生的免疫应答水平。试验将20只4周龄的雄性昆明小鼠随机分为A、B、C、D 4个组。免疫A组接种纯化后的重组蛋白rMseno;免疫B组接种经IPTG诱导表达后的重组菌E.coli-Mseno;对照C组接种等量PBS;对照D组接种未经过诱导表达的重组菌E.coli-Mseno。通过ELISA检测方法分别测定血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平及γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）细胞因子水平,最后通过脾脏淋巴细胞增殖试验来反映小鼠体内T淋巴细胞的增殖情况。结果显示,构建的重组pET-15b-eno质粒目的基因片段大小为1 632 bp,与预期大小相同;纯化的重组蛋白rMseno大小为61 ku,并能够被鼠抗猪附红细胞体血清所识别;免疫A组和免疫B组小鼠血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平以及T淋巴细胞增殖指数均显著或极显著高于对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,猪附红细胞体eno基因重组蛋白能够诱导小鼠产生较高的体液免疫水平以及细胞免疫应答水平。     

Immune response and protective efficacy against homologous challenge in BALB/c mice vaccinated with DNA vaccine encoding Toxoplasma gondii actin depolymerizing factor gene

A DNA vaccine (pVAX1-TgADF) encoding Toxoplasma gondii actin depolymerizing factor (ADF) gene was constructed and the immune response and protective efficacy of this vaccine against homologous challenge in BALB/c mice were evaluated. High titers of specific antibody and increases in the percentage of CD4(+) and CD8(+) T lymphocyte cells were observed from BALB/c mice vaccinated with pVAX1-TgADF (P<0.05), when PBS group was used as control. The survival time of BALB/c mice in pVAX1-TgADF group was longer than those in control groups. The numbers of brain cysts in the experimental BALB/c mice immunized with pVAX1-TgADF reduced significantly compared with those in PBS group (P<0.05), and the rate of reduction could reach to around 42.8%. These results suggested that the DNA vaccine pVAX1-TgADF could generate specific humoral and cellular immune responses, prolong survival times, and reduce brain cysts load against T. gondii infection in BALB/c mice.     

Toxoplasma gondii rhomboid protein 1 (TgROM1) is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis

Infection with the intracellular protozoan parasite Toxoplasma gondii causes serious public health problems and is of great economic importance worldwide. The rhomboid proteins which are responsible for adhesion and invasion of host cells have been suggested as vaccine candidates against toxoplasmosis. A DNA vaccine (pVAX-ROM1) encoding T. gondii rhomboid protein 1 (TgROM1) gene was constructed and the immune response and protective efficacy of this vaccine against lethal challenge in BALB/c mice were evaluated. The results indicated that specific antibody and lymphocyte proliferative responses were elicited in mice receiving pVAX-ROM1. The production levels of IFN-γ, IL-2, IL-4, and IL-10, as well as the percentage of CD4(+) cells in mice vaccinated with pVAX-ROM1 were significantly increased respectively, compared to controls receiving either pVAX1 alone or PBS. After lethal challenge, the mice immunized with pVAX-ROM1 showed an increased survival time compared with the mice in the controls. Our data suggested that a DNA vaccine pVAX-ROM1 encoding T. gondii rhomboid protein 1 triggered strong humoral and cellular responses, and prolonged survival time against T. gondii infection in BALB/c mice.     

隐孢子虫AOX和TSP6核酸疫苗的制备及免疫保护性研究

旨在制备微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)线粒体蛋白(AOX)基因和微线体蛋白(TSP6)基因的DNA疫苗,评价其对贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)感染雏鸡的免疫保护性。根据GenBank库中AOX和TSP6基因的序列设计引物,扩增出编码2个保护性抗原基因的DNA片段,利用DNA重组技术将2个目的片段分别克隆到真核表达载体pVAX1,制成核酸疫苗pVAX1-AOX和pVAX1-TSP6。将制备的核酸疫苗肌肉注射免疫雏鸡,共分为4组,pVAX1组,pVAX1-AOX组,pVAX1-TSP6组,pVAX1-AOX+pVAX1-TSP6组,2周后检测雏鸡血清IgG抗体滴度和细胞因子(IL-4和IFN-γ)水平的变化。结果显示,免疫组中鸡的血清特异性IgG抗体水平、细胞因子IFN-γ都有明显的升高。攻卵囊试验结果表明,免疫组比对照组的排卵囊量明显减少,且排卵囊时间有所缩短。表明制备的pVAX1-AOX和pVAX1-TSP6核酸疫苗有较好的免疫保护作用。