猪附红细胞体eno基因重组蛋白的制备及免疫效果研究

为了研究猪附红细胞体eno基因重组蛋白的免疫效果,本试验将猪附红细胞体eno基因与pET-15b载体进行连接,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。对表达菌株进行诱导表达、纯化,利用纯化后的猪附红细胞体eno重组蛋白(命名为rMseno)对小鼠进行免疫,从而评价该重组蛋白在小鼠体内产生的免疫应答水平。试验将20只4周龄的雄性昆明小鼠随机分为A、B、C、D 4个组。免疫A组接种纯化后的重组蛋白rMseno;免疫B组接种经IPTG诱导表达后的重组菌E.coli-Mseno;对照C组接种等量PBS;对照D组接种未经过诱导表达的重组菌E.coli-Mseno。通过ELISA检测方法分别测定血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平及γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)细胞因子水平,最后通过脾脏淋巴细胞增殖试验来反映小鼠体内T淋巴细胞的增殖情况。结果显示,构建的重组pET-15b-eno质粒目的基因片段大小为1 632 bp,与预期大小相同;纯化的重组蛋白rMseno大小为61 ku,并能够被鼠抗猪附红细胞体血清所识别;免疫A组和免疫B组小鼠血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平以及T淋巴细胞增殖指数均显著或极显著高于对照组(P0.05;P0.01)。结果表明,猪附红细胞体eno基因重组蛋白能够诱导小鼠产生较高的体液免疫水平以及细胞免疫应答水平。     

撒坝猪源大肠杆菌高致病性毒力岛诱导病理损伤的超微结构特征

为探究撒坝猪源大肠杆菌（E.coli）高致病性毒力岛（HPI）诱导小鼠病理损伤的超微结构特征,本研究将实验室保存的E.coli HPI阳性株（HPI⁺）和E.coli HPI基因缺失株（^ΔHPI）进行复苏和培养,分别用E.coli HPI⁺、E.coli ^ΔHPI菌株以腹腔接种的方式感染昆明小鼠,检测菌株的半数致死量（50% lethal dose,LD₅₀）,通过HE染色和透射电镜观察并分析菌株对小鼠病理损伤的超微结构特征,利用免疫组织化学标记白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）阳性细胞在被感染小鼠肝脏和肾脏组织中的分布,以反映E.coli HPI⁺及E.coli ^ΔHPI菌株所引起炎症水平的差异。结果显示,E.coli HPI⁺和E.coli ^ΔHPI菌株的半数致死量分别为1×10^7.39和1×10^8.62 CFU/mL;HE染色显示,E.coli感染小鼠后,可见肝脏细胞肿胀、变性,肝窦淤血,肾脏间质淤血,肾小管上皮细胞变性脱落等病理变化;超微结构变化显示,肝脏细胞的完整形态消失,胞核呈不规则形态,线粒体畸形,粗面内质网上核糖体脱落,滑面内质网增生;多数肾小管上皮细胞出现胞核固缩,部分细胞核核仁边移、体积增大,足突融合,系膜细胞间隙变宽。此外,E.coli HPI⁺感染组小鼠于肝脏、肾脏的水肿现象较E.coli ^ΔHPI菌株感染的小鼠更为明显。免疫组化结果显示,大肠杆菌感染小鼠后,IL-1β蛋白主要表达于肝细胞、中央静脉周围、肾间质细胞和肾小管上皮细胞,且E.coli HPI⁺感染组的IL-1β表达量高于E.coli^ΔHPI感染组。综上所述,撒坝猪源E.coli HPI能够调控E.coli对小鼠的致病性,HPI的调控作用可使E.coli对小鼠肝脏、肾脏造成的病变及超微结构变化更明显,并且能够增加小鼠的炎症反应。     

猪附红细胞体感染BALB/c小鼠模型的建立及相关指标检测

通过建立猪附红细胞体感染BALB/c小鼠模型,检测BALB/c小鼠外周血中血细胞的变化特征,同时检测感染小鼠血浆中红细胞表面分子CD35分子(Ⅰ型补体受体),进一步揭示附红细胞体的免疫致病机理。结果显示小鼠感染猪附红细胞体随感染时间的增加,红细胞数量呈降低趋势,白细胞数量呈升高趋势,且两者呈负相关。CD35的表达水平显著增高,说明附红细胞体感染可降低机体免疫水平。     

布鲁菌转录调节因子HFQ诱导机体免疫反应的分析

旨在分析布鲁菌（Brucella）转录调节因子HFQ诱导机体产生的免疫反应。以热灭活牛种布鲁菌S2308为模板,根据GenBank登录的S2308 hfq基因序列（BAB1_1134）设计引物,PCR扩增hfq基因片段后,将其克隆至原核表达载体pET-32a,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导HFQ蛋白表达;利用SDS-PAGE电泳以及Western blot对重组HFQ蛋白（rHFQ）进行分析;pET-32a空载体、rHFQ和疫苗株M5-90刺激小鼠巨噬细胞RAW 264.7,利用ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ和IL-4的表达水平;将pET-32a、rHFQ和M5-90免疫小鼠后,检测小鼠脾细胞中IFN-γ和IL-4的水平,以及小鼠血清中IgG抗体水平。结果显示,hfq基因大小为237 bp,编码79个氨基酸,rHFQ大约在25.8 ku处出现蛋白条带,纯化后为单一条带。Western blot结果显示,rHFQ具有较好的反应原性。rHFQ刺激RAW 264.7后,诱导IFN-γ和IL-4的水平与M5-90组相似,显著高于PBS组和pET-32a空载体组,且随着刺激时间的延长而升高。rHFQ免疫小鼠后,诱导脾细胞产生IFN-γ和IL-4的水平,小鼠血清中IgG的水平与M5-90组相似,显著高于PBS组和pET-32a空载体组。布鲁菌HFQ蛋白具有较好的反应原性,并能诱导机体产生较高的细胞免疫和体液免疫水平,是布鲁菌亚单位疫苗研制较理想的候选抗原。     

表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌在小鼠诱导的免疫应答分析

旨在构建表达猪圆环病毒2型（PCV2）cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri,L.reuteri）,并评价其在小鼠体内诱导的免疫应答效果。利用PCR扩增实验室分离保存的PCV2b型毒株的cap蛋白基因,以猪源L.reuteri为宿主菌,构建表达cap蛋白的重组菌株pPG-T7 g10-PPT-cap/L.reuteri,通过口服免疫BALB/c小鼠。采用间接ELISA方法测定免疫后小鼠血清中抗原特异性IgG抗体水平,粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中抗原特异性sIgA抗体水平,小鼠血清中各细胞因子水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平;流式细胞技术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞的水平;荧光定量PCR检测免疫后攻毒的小鼠体内器官的病毒载量。结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组（P<0.01）;小鼠粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中sIgA抗体水平显著高于对照组（P<0.01）;小鼠血清中细胞因子水平和对照组相比,IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平升高,IL-10水平降低,IFN-α无显著变化;体外孵育PCV2和小鼠脾淋巴细胞结果表明,重组乳酸菌组小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数显著高于对照组（P<0.01）;流式细胞技术检测结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠脾细胞中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞含量高于对照组;荧光定量PCR结果显示,相比于对照组,口服免疫重组乳酸菌组小鼠体内的病毒载量明显低于对照组。综上所述,本研究成功构建了表达PCV2 cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌,经口服途径免疫动物,构建的重组乳酸杆菌能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,且具有一定的免疫保护效果。     

灭活大肠杆菌与脂多糖诱导猪肠黏膜上皮细胞表达RegⅢγ的机理研究

试验旨在探索革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）及其表面分子脂多糖（LPS）诱导胰腺再生蛋白Ⅲγ（RegⅢγ）表达调控的机制。首先,用不同浓度灭活E.coli（10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ CFU/mL）和LPS （0.01、0.1、1、5、10、20、40、80 μg/mL）诱导猪肠黏膜上皮细胞（IPEC-JⅡ）,用MTT法测D_{490 nm}值,检测E.coli和LPS对IPEC-JⅡ细胞活力的影响;其次,用不同浓度灭活E.coli（10⁷、10⁶、10⁵ CFU/mL）和LPS （0.01、0.1、1、5 μg/mL）处理IPEC-JⅡ细胞24 h,用实时荧光定量PCR和Western blotting检测RegⅢγ mRNA和蛋白的表达;最后,用1 μg/mL LPS处理IPEC-JⅡ细胞24 h,用实时荧光定量PCR和Western blotting检测p65、p38、JNK、ERK mRNA和蛋白表达及磷酸化水平。结果显示,除0.01 μg/mL LPS不抑制IPEC-JⅡ细胞活力外,其他浓度的灭活E.coli和LPS均可抑制IPEC-JⅡ细胞活力,且10⁹、10⁸ CFU/mL E.coli和10、20、40、80 μg/mL LPS组细胞活力极显著下降（P<0.01）;与对照组相比,10⁷、10⁶和10⁵ CFU/mL E.coli均能诱导RegⅢγ表达增加,且10⁵ CFU/mL E.coli组RegⅢγ mRNA表达量极显著高于对照组（P<0.01）,蛋白表达量显著高于对照组（P<0.05）;0.01、0.1、1和10 μg/mL LPS均能诱导RegⅢγ表达增加,且0.1和1 μg/mL LPS组RegⅢγ mRNA表达量极显著高于对照组（P<0.01）,RegⅢγ蛋白表达虽有增加趋势,但差异不显著（P>0.05）;与对照组相比,1 μg/mL LPS组p65、p38 mRNA表达量极显著增加（P<0.01）,JNK、ERK mRNA表达量显著增加（P<0.05）;同时,p38、JNK蛋白表达量和磷酸化水平均极显著增加（P<0.01）,p65蛋白磷酸化水平显著增加（P<0.05）,ERK蛋白和磷酸化水平均增加,但差异不显著（P>0.05）。以上结果表明,灭活E.coli和LPS均可诱导RegⅢγ表达,1 μg/mL LPS可增加p65、p38和JNK蛋白的磷酸化水平。     

绵羊NYD-SP27基因的原核表达及生物信息学分析

本研究旨在对绵羊NYD-SP27基因进行克隆和原核表达，并对其表达的蛋白进行生物信息学分析。根据GenBank中绵羊NYD-SP27基因序列（登录号：KX905090）设计1对特异性引物，通过PCR方法扩增目的基因片段，构建pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞，提质粒进行双酶切鉴定，将鉴定正确的pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达，对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定，并利用生物信息学方法对NYD-SP27基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示，试验成功扩增出大小为1 617 bp的NYD-SP27基因片段，并经NdeⅠ和Xho Ⅰ双酶切获得大小为5 400和1 617 bp的两条片段，表明成功构建了pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒，诱导表达重组蛋白大小约60 ku，主要以包涵体的形式存在。NYD-SP27蛋白分子式为C₂₇₉₈H₄₃₁₉N₇₃₇O₈₁₉S₁₉，原子总数为6 892，理论等电点（pI）为6.16，为酸性蛋白，不稳定系数为46.96，属于不稳定蛋白，总平均亲水性为-0.403。该蛋白无跨膜结构，无信号肽，含有45个潜在的磷酸化位点和24个抗原表位；NYD-SP27蛋白二级结构中的α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲分别占26.21%、3.90%、18.03%和51.86%。本试验结果可为深入研究绵羊NYD-SP27蛋白的作用机理提供理论依据。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验(IFTA)鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组:重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG_1、IgG_(2a)抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4~+和CD8~+含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10~9 PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG_1、IgG_(2a)抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4~+、CD8~+含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组(P0.05;P0.01)。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。     

猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立以猪附红细胞体α-烯醇化酶(ENO)重组蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法。本实验将猪附红细胞体ENO基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-ENO,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,并对其表达产物纯化及western blot鉴定。以ENO重组蛋白为包被抗原,优化反应条件,建立了猪附红细胞体ENO基因的间接ELISA检测方法。结果显示,经原核表达获得了分子量约为69 ku的重组蛋白,主要以可溶性形式存在;经western blot鉴定,纯化后的蛋白具有良好的反应原性。以纯化的ENO重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法,优化后的反应条件为:抗原的最适包被浓度为20.5μg/mL;最佳封闭条件为3%的脱脂乳封闭2 h;待检血清最适稀释倍数为1:80;兔抗猪HRP-IgG最佳稀释倍数为1:1 000;OPD显色时间为15 min;特异性试验结果显示,所建立的间接ELISA检测方法与猪弓形虫、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、猪链球菌等均无交叉反应;该方法检测猪附红细胞体阳性血清的灵敏度为1:320;批内和批间重复性变异系数均低于5%;应用所建立的间接ELISA检测方法与IFA检测方法平行检测50份采自延边地区某猪场的猪血清样本,两种方法的总符合率为90%。本研究建立的间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可初步应用于猪附红细胞体血清学检测。     

猪链球菌rGDH蛋白原核表达载体的构建及免疫原性分析

谷氨酸脱氢酶(GDH)在猪链球菌35个血清型中都存在,是一种具有免疫原性的保护性抗原。本试验PCR扩增出GDH基因,酶切定向插入pET-32a中构建表达载体pET-32a-GDH,将其转化E.coli BL21(DE3)表达菌中,培养并诱导表达rGDH蛋白,产物纯化后免疫新西兰白兔,免疫攻毒保护试验检验该蛋白的免疫原性。PCR试验获得约1 300 bp的GDH基因,双酶切pET-32a-GDH表达载体获得5.4和1.3 kb的片段,IPTG诱导表达获得融合蛋白,免疫保护结果达到70%。结果表明,本试验成功构建表达猪链球菌GDH蛋白的原核表达载体pET-32a-GDH,rGDH蛋白以蜂胶为佐剂免疫模型动物后,免疫保护率达到70%,为猪链球菌亚单位疫苗的研制提供了技术支持。     

Construction and Immunogenicity Analysis of Streptococcus suis rGDH Prokaryotic Expression Vector

Glutamate dehydrogenase (GDH) which exists in 35 serotypes of Streptococcus suis,is an immunogenic protective antigen.Therefore,the GDH gene was amplified by PCR method,and the GDH gene PCR fragment was inserted oriented to pET-32a to construct a new recombinant expression vector pET-32a-GDH.The E.coli BL21(DE3)(pET-32a-GDH) was cultured and induced to express the rGDH protein.New Zealand White rabbits were immunized by the purified rGDH protein for immunity protective test to determine the immunogenicity of the protein.The results showed that the recombinant expression vector pET-32a-GDH was successfully constructed,and the rGDH protein was efficiently and solubly expressed.70% of model animals immuned by the rGDH protein with propolis as adjuvant were protected after injection of Streptococcus suis type 2 as a virulent pathogen.The experiment results provided technical support for the development of subunit vaccine of Streptococcus suis.     

牛源坏死梭杆菌43K外膜蛋白的黏附特性研究

旨在明确牛源坏死梭杆菌43K OMP的黏附特性。将43K OMP基因克隆连接至pET-32a载体,转化入大肠杆菌BL21 DE3中,通过IPTG诱导进行原核表达,应用黏附试验、天然蛋白竞争试验、抗体抑制试验和蛋白酶水解试验,明确牛源坏死梭杆菌43K OMP的黏附性,同时将纯化的重组蛋白和提取的天然43K OMP与牛子宫内膜细胞和牛乳腺上皮细胞共孵育,观察43K OMP对细胞的黏附作用。结果显示：43K OMP基因克隆到pET-32a载体中,随后在大肠杆菌BL21 DE3以包涵体形式成功表达;携带重组质粒(H2019)的大肠杆菌经IPTG诱导后,与空载体对照相比,与宿主细胞的结合显著增强(P<0.05);天然43K OMP与细胞共孵育后,黏附细胞的细菌数量显著降低(P<0.05);H2019与43K OMP多抗或单抗预孵育后,显著降低黏附宿主细胞的细菌数量(P<0.05);经不同浓度蛋白酶K处理H2019后,黏附细胞的细菌数量显著降低(P<0.05),且与蛋白酶K浓度呈现剂量依赖关系。同时,43K OMP天然蛋白和重组蛋白能黏附于牛子宫内膜细胞和乳腺上皮细胞表面。...     

非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

犬降钙素原蛋白多克隆抗体制备及应用分析

试验旨在获得高纯度犬降钙素原（procalcitonin,PCT）重组蛋白,并对该蛋白的临床应用进行分析。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将PCT基因克隆至原核表达载体pET-30a（+）中,经双酶切和测序鉴定阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,采用镍柱进行重组蛋白的纯化,纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测重组蛋白与犬PCT多克隆抗体的特异性,采用ELISA法检测健康犬和炎症犬血清PCT。双酶切及测序结果显示,犬PCT基因成功插入pET-30a（+）,未出现碱基突变;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量为14.9 ku,间接ELISA法测定的免疫小鼠血清抗体效价达1：51 200。Western blotting结果表明,制备的多抗血清具有很好的特异性;ELISA结果显示,炎症犬血清内检测到PCT,且其浓度与炎症反应程度呈正相关。结果表明,本研究成功制备了犬PCT蛋白多克隆抗体,且犬血清PCT蛋白是一种潜在的新型严重细菌性炎症感染指示物。     

Construction and High Level Expression of Prokaryotic Expression Vector of Pig Interferon-δ Gene

Interferon (IFN) had recieved much more attention because of its broad-spectrum antiviral, antitumor activity and immune regulation.One pair of primers were designed for amplifying pig IFN-δ gene with PCR method according to the relevant sequence from GenBank.The IFN-δ gene was cloned into prokaryotic expression vector, and the recombinant plasmid was obtained.We transformed the recombinant plasmid into E.coli Transetta BL21(DE3) strain and the protein expression was identified by SDS-PAGE and Western blotting.The results showed that pET-30a-DsbA-IFN-δ recombinant protein was 20 ku and expressed mainly in the form of inclusion body, these expressed protein could specific react with His-tag monoclonal antibody.     

猪干扰素-δ基因原核表达载体的构建及高效表达

干扰素(interferon,IFN)因具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节作用而备受关注。本研究根据GenBank上公布的猪IFN-δ核苷酸序列设计1对引物,通过PCR方法扩增出猪 IFN-δ基因,片段大小为513 bp,并将其克隆到原核表达载体上得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta BL21(DE3)受体菌,经SDS-PAGE电泳分析,结果表明,pET-30a-DsbA-IFN-δ表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约20 ku,且主要以包涵体形成存在,经Western blotting分析发现表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。     

瑶山亚种树鼩ISG15蛋白表达及其多克隆抗体制备

[目的] 克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15（interferon stimulating gene 15,ISG15）基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础。[方法] 提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞（baby hamster syrian kidney,BHK-21）;同时亚克隆到原核表达载体pET-28a（+）构建重组表达质粒pET-28a-ISG15,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩ISG15蛋白;重组蛋白经镍离子亲和层析法纯化并免疫小鼠,获得鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体,利用Western blotting和间接免疫荧光技术（IFA）检测其反应性。[结果] 成功克隆瑶山亚种树鼩ISG15基因,并构建了其真核和原核表达载体,真核表达载体在BHK-21细胞中能高效表达;原核表达载体在大肠杆菌中30 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h获得重组蛋白（分子质量22 ku）,蛋白以包涵体形式表达,经镍离子亲和层析法得到纯化。乳化后的重组蛋白免疫小鼠,获得抗瑶山亚种树鼩ISG15的多克隆抗体,经Western blotting检测,制备的鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体稀释度在1：8 000时仍能够与0.01 μg ISG15重组蛋白结合。IFA检测发现,多克隆抗体能与真核细胞过表达的蛋白反应,抗体反应性良好。[结论] 构建的原核表达载体在大肠杆菌中高效表达瑶山亚种树鼩ISG15蛋白,重组蛋白纯化复性后具有良好免疫原性,获得的多克隆抗体为进一步研究树鼩抗病毒感染免疫奠定了良好基础。     

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。     

大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤的研究

试验旨在研究大肠杆菌（E.coli）对奶牛子宫内膜上皮细胞（bovine endometrial epithelial cells,BEECs）的体外炎性损伤,探究大肠杆菌引发炎性反应的最佳浓度、作用时间及机制。首先,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵、1×10⁶、2.5×10⁶、5×10⁶ CFU/mL）诱导刺激细胞3、6和9 h,通过倒置显微镜观察细胞形态、CCK-8法测D_{450 nm}值,检测大肠杆菌对细胞活性的影响;其次,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵ CFU/mL）处理细胞3、6和9 h,用ELISA方法检测细胞上清液中白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌量;最后,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵ CFU/mL）处理细胞6和9 h,用Western blotting检测核因子κB抑制蛋白α（IκBα）和p65蛋白的磷酸化水平。结果显示,与对照组相比,大肠杆菌感染细胞9 h后,1×10⁶、2.5×10⁶和5×10⁶ CFU/mL大肠杆菌组细胞活性均极显著降低（P<0.01）,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组显著降低（P<0.05）;大肠杆菌感染细胞9 h后,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α极显著升高（P<0.01）;大肠杆菌感染细胞6 h后,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组IκBα、p65蛋白磷酸化水平和IL-6均极显著升高（P<0.01）,5×10⁴ CFU/mL大肠杆菌组IκBα和p65蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.05）。结果表明,大肠杆菌可以刺激奶牛子宫内膜上皮细胞产生炎性反应,且当细胞与5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌作用6 h或与5×10⁴ CFU/mL大肠杆菌作用9 h为最佳。