牛支原体NOX2的原核表达及黏附特性

旨在探究牛支原体（Mycoplasma bovis,Mb）NADH氧化酶NOX2的生物学功能,本研究参照GenBank中Mb湖北分离株（Mb Hubei-1 strain）nox2基因序列设计引物,应用PCR扩增获得Mb临洮分离株的nox2基因,在测序及序列优化的基础上,构建原核表达载体pET-nox2,并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中诱导表达,进而对表达产物rMbNOX2的酶促活性、免疫原性,NOX2在Mb内的分布,rMbNOX2抗血清的补体介导体外杀菌活性和对Mb黏附宿主细胞的抑制活性进行了分析。结果表明,Mb临洮株nox2基因全长1 350 bp,与GenBank中已知序列的Mb nox2基因序列比较,除Mb JF4278株相似性为97.93%外,其余均为99.93%。SDS-PAGE结果显示,优化的nox2基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白rMbNOX2相对分子质量约为67 ku,且具有良好的酶促活性;ELISA与Western blot结果显示,rMbNOX2具有良好的免疫原性,且Mb NOX2在细胞浆中的分布多于细胞膜;补体介导的体外杀菌试验及黏附抑制试验证实,rMbNOX2抗血清具有明显的补体介导杀支原体活性,并可有效抑制Mb对宿主细胞的黏附。本研究为深入探讨Mb NOX2生物学功能奠定了基础。     

密码子优化的甲型H1N1流感病毒HA基因DNA疫苗在小鼠体内免疫保护效力研究

为了提高甲型H1N1流感病毒HA基因DNA疫苗的免疫原性,本研究将流感病毒rPan09(HA和NA来自A/California/04/09,其余6个片段来自PR8的重组病毒)的HA基因通过人工合成的方法将其密码子优化为哺乳动物体内偏嗜性密码子opti-HA,同未优化的rPan09的HA基因分别与真核表达载体pCAGGS连接构成重组质粒pCA-optiHA和pCA-HA转染293T细胞,48 h后采用间接免疫荧光的方法检测HA基因的体外表达情况,结果显示重组质粒pCA-optiHA的蛋白表达量明显高于pCA-HA。为评价这两种重组质粒的免疫及保护效力,选取6~8周龄雌性BALB/c小鼠,将质粒pCA-HA、pCA-optiHA以100μg/只的剂量,进行后腿肌肉多点注射,同时设立空载体pCAGGS对照,共免疫3次,每次间隔2周。结果表明DNA疫苗pCA-optiHA可显著提高小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。三免2周后用107.45EID50的rPan09采用滴鼻方式进行攻毒,用Real-time PCR及制作肺组织石蜡切片检测DNA疫苗的保护效力。结果表明,pCA-optiHA免疫组的保护效力明显高于pCA-HA免疫组。本研究为进一步研究和设计有效的甲型流感病毒DNA疫苗奠定了基础。     

重组高产H1N1亚型猪流感疫苗株的构建与鉴定

为制备一株猪流感灭活疫苗的候选毒株,本研究利用反向遗传学技术,将A/swine/Guangdong/1/11(H1N1)毒株的HA、NA基因和A/PR/8/34毒株的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因进行重组,成功拯救出鸡胚高度适应性毒株rH1N1。抗原性分析显示rH1N1保留了亲本毒株良好的抗原性。rH1N1接种10日龄鸡胚48 h后,血凝价达到210,表明该毒株能在鸡胚中高水平复制。该毒株为H1N1亚型猪流感灭活疫苗的研制奠定了坚实的物质基础。     

滑液支原体WVU1853株热不稳定延伸因子的表达及黏附特性分析

旨在探究滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)热不稳定延伸因子(elongation factor thermo unstable,EF-Tu)的黏附特性.参照GenBank中MS WVU1853株EF-Tu序列,设计引物对Tu-F/Tu-R,利用PCR扩增获得MS EF-Tu基因后,将其克隆入pE...     

复方天门冬多糖注射液的靶动物（鸡）安全性试验

【目的】研究复方天门冬多糖注射液对靶动物（鸡）的安全性,为其临床用药提供参考依据。【方法】以鸡为靶动物进行肌肉注射给药,然后对试验鸡的临床症状、体重变化、饲料报酬及血液常规指标、血液生化指标等进行安全性评估,以确定受试药物的最大耐受剂量或耐受范围。【结果】鸡只注射复方天门冬多糖注射液后,能明显增加其日均增重和降低饲料报酬,促进鸡体生长发育,尤其以5倍剂量组（10.0 mL/kg）的效果最佳;在血液常规指标方面,除血小板数呈明显降低趋势外,白细胞数、红细胞数、红细胞压积、血红蛋白含量等指标的变化不明显,且不同处理组间的差异不显著（P＆gt;0.05）;在血液生化指标方面,注射复方天门冬多糖注射液后1周内各项生化指标呈无规律的升高或降低变化趋势,至给药后第14 d（31日龄）,则以5倍剂量组的各项指标较接近于正常水平。【结论】复方天门冬多糖注射液是一种有效的免疫增强剂,能促进鸡体生长发育,且在实际生产应用中具有较高的安全性,其在靶动物（鸡）上的最大耐受剂量为10.0 mL/kg。     

牛支原体P48蛋白诱导EBL细胞增殖和凋亡的研究

试验旨在研究牛支原体P48蛋白对胎牛肺（embryonic bovine lung,EBL）细胞增殖和凋亡的影响。收集不同时间段、不同浓度P48蛋白与EBL细胞共孵育的样品,通过MTT法检测细胞增殖率;DAPI染核法观察EBL细胞核形态变化;流式细胞技术检测该蛋白诱导EBL细胞的凋亡率;实时荧光定量PCR检测凋亡标志物的mRNA相对表达变化;Western blotting方法检测Bax和Beclin-1蛋白表达水平。结果显示：当作用时间为72 h,P48蛋白浓度在10 μg/mL时,对EBL细胞增殖有极显著的抑制作用（P<0.01）,在0.1和0.5 μg/mL时对EBL细胞的增殖的抑制作用不显著（P>0.05）;经蛋白诱导12 h细胞核形态未有明显变化,24 h细胞核形态发生皱缩和凝聚,48和72 h细胞核发生碎裂;凋亡标志基因mRNA表达在2和12 h没有明显提高,在24、48、72 h有显著提高,与作用时间呈正相关,同时凋亡相关蛋白Bax和Beclin-1的表达随之显著提高。流式细胞技术结果显示P48蛋白诱导EBL细胞凋亡率为48.44%。综上表明,牛支原体P48重组蛋白能够抑制EBL细胞的增殖,促进细胞凋亡,为进一步揭示牛支原体的致病机制提供参考依据。     

牛支原体武威株脂蛋白P48基因的克隆、原核表达及亚细胞定位

【目的】验证牛支原体P48蛋白在细胞中的位置,并为后续功能的研究奠定基础.【方法】运用Overlap PCR扩增获得点突变后的牛支原体武威分离株P48基因,并将其克隆至pGEM-T Easy,将测序正确的质粒克隆至表达载体pET-28a中,构建原核表达质粒pET-P48,表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),并在IPTG诱导下成功获得融合蛋白表达产物rMbP48,大小约为51ku.重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.在分离牛支原体膜蛋白的基础上应用Western-blot及间接ELISA对P48蛋白在细胞中的分布进行分析.【结果】P48蛋白主要存在于牛支原体的膜分离相.全菌免疫荧光试验进一步证实脂蛋白P48位于牛支原体的膜表面.【结论】牛支原体P48蛋白是存在于牛支原体表面的一种具有免疫原性的脂蛋白.本研究为进一步研究P48蛋白的生物学特性及建立高效的牛支原体诊断方法奠定了基础.     

H1亚型流感病毒通用疫苗的构建及其对小鼠免疫保护效力研究

本研究旨在为研制一种安全、有效并具有广泛保护作用的流感病毒通用疫苗进行初步的探索。从Gen-Bank上获得所有H1亚型经典猪源流感病毒和甲型流感病毒的HA基因序列,通过系统进化分析获得其共有序列,并对共有序列进行密码子优化(Optimized consensus,opti-CS),同时将H1亚型的A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和重组甲型流感病毒rPan09(H1N1,其HA和NA来自A/Swine/California/04/09,其余6个片段来自PR8的重组病毒)的HA基因分别进行密码子优化(opti-G11,opti-r09),并将这3种片段与真核表达载体pCAGGS连接获得重组质粒pCA-opti-CS、pCA-opti-G11和pCA-opti-r09。将重组质粒瞬时转染293T细胞,检测HA基因在哺乳动物细胞中的表达情况。免疫6～8周雌性BALB/c小鼠,免疫3次,每次间隔3周,同时设立空载体pCAGGS对照。三免2周后从每个质粒免疫组中选取一半小鼠每只以50μL 103.87 EID50的剂量接种A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)病毒,另一半小鼠每只以50μL 107.45 EID50的剂量接种rPan09病毒。采集血清,对HA抗体水平、HI滴度、细胞因子产生情况、肺组织病毒含量进行检测,并对肺组织病理学变化进行观察。结果显示:重组质粒中HA基因均能够在哺乳动物细胞中有效的表达。pCA-opti-CS免疫后能够诱导小鼠产生较高的HA抗体水平,较高的HI滴度,并且能够诱导机体产生较高水平的IL-4和IFN-γ。肺组织病毒含量测定以及组织病理学观察结果显示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS免疫后能够有效限制病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和rPan09HA在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。结果提示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,并具有较好的交叉保护效力,能够保护小鼠抵抗异源流感病毒的攻击。本研究为流感通用疫苗的研究提供了有益的参考。     

泡状带绦虫线粒体ND1基因的克隆及序列比对分析

针对带绦虫线粒体DNA的ND1基因设计引物扩增目的基因,使用基因分析软件Larsergene V7.1与GenBank已知带绦虫基因进行比对分析。实验成功扩增泡状带绦虫甘肃地区虫株X2线粒体基因组的ND1基因。分析结果显示,泡状带绦虫ND1基因种间不同虫株的基因同源性均在98.8%~99.5%之间,ND1基因推导的氨基酸序列与其他泡状带绦虫的蛋白同源性均在98.5%~99.2%之间,其中与四川地区的虫株同源性均达到了99.2%。推断泡状带绦虫线粒体DNA的ND1基因相对保守,与Taenia sp. AL-2012、Taenia regis和猪带绦虫差异较明显,最高只有91.3%,可以作为泡状带绦虫的初步鉴别基因。